釀酒酵母發酵提取羅馬洋甘菊活性成分研究

牛 浩，王鵬宇，于金澎，隋麗媛

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

研究表明，多酚和黃酮具有良好的清除超氧陰離子、DPPH自由基的能力[1]，且具有抗菌、抗炎等功效[2]。近年來，人們更注重安全健康，食品、藥品、化妝品中越來越多地加入天然植物成分，以達到環保和健康的要求。羅馬洋甘菊中含有天然的多酚和黃酮等抗氧化劑[3]，目前提取羅馬洋甘菊成分大多采用乙醇提取法，但采用乙醇提取技術得到的成分應用于化妝品原料中出現了溶解性差、生物利用度低等問題。

微生物發酵是一種傳統的提取方法，已廣泛應用于中藥材和天然植物的提取，并應用于醫藥、食品、化妝品等領域[4]。微生物發酵提取天然植物能顯著影響植物提取物的功效，富集有效成分，增加如黃酮類、萜內酯等有效成分的含量[5]，同時解決了有效成分溶解性差和生物相容度低的問題?；诖?，利用釀酒酵母發酵提取羅馬洋甘菊的總多酚和總黃酮，考察不同因素對成分提取率的影響，得到較優的實驗提取工藝條件，為羅馬洋甘菊活性成分的提取提供了新的思路和方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

721G 紫外分光光度計(上海精科有限公司生產)、培養箱(美墨爾特貿易有限公司生產)、釀酒酵母(北納生物生產)、羅馬洋甘菊(黑龍江佳木斯種植生產)、pH計(上海儀電科學生產)。

1.2 標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線：精密稱取干燥的蘆丁標準品，用60%乙醇稀釋至相應濃度，依次加入5%的NaNO2溶液、10% Al(NO3)3溶液和4%NaOH溶液，室溫下避光靜置15 min，測量在510 nm下樣品溶液吸光度，平行測定3組。以蘆丁濃度為橫坐標，以不同濃度所對應的吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。

沒食子酸標準曲線：精密稱取干燥的沒食子酸標準品，用蒸餾水稀釋至相應濃度，分別加入福林酚試劑，2 mL 20%的碳酸鈉溶液，混勻，避光反應10 min，測量在765 nm下樣品的吸光度，平行測定3組。以沒食子酸濃度為橫坐標，以不同濃度所對應的吸光度為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線。

1.3 釀酒酵母發酵提取羅馬洋甘菊活性成分試驗

接菌量影響試驗：配制溶液，滅菌后放涼，待用。分別按照不同接菌率，接入釀酒酵母，28℃培養箱中發酵3 d。

發酵時間影響試驗：按照上述實驗確定的接菌率配制溶液，置于28℃培養箱中分別培養不同天數。

料液比影響試驗：配制不同料液比溶液，滅菌后放涼，待用。按照上述實驗確定的接菌率，接入釀酒酵母，置于28℃培養箱中培養3 d。

1.4 發酵液中總黃酮和總多酚提取率的計算

將得到的發酵液離心，按照繪制蘆丁標準曲線和沒食子酸標準曲線的實驗步驟分別測定上清液在510 nm和765 nm下吸光度，再分別代入蘆丁標準曲線和沒食子酸標準曲線中，計算發酵液中總黃酮和總多酚的提取率。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

蘆丁標準曲線和沒食子酸標準曲線如圖1所示。結果顯示，蘆丁濃度在0.2～1 mg/mL、沒食子酸濃度在20～80 μg/mL均呈良好的線性關系，可以用于提取物中總黃酮和總多酚含量的計算。

圖1 標準曲線 a:蘆丁標準曲線；b:沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve a: rutin standard curve; b: gallate standard curve

2.2 接菌率對發酵液中總黃酮和總多酚提取率影響的分析

實驗考察了不同接菌率對發酵液中總黃酮和總多酚提取率的影響，其結果如圖2所示。

從圖2中看到，隨著釀酒酵母接菌率的增加，發酵液中總多酚和總黃酮的提取率先升高后降低，接菌率8%時，兩種成分的提取率均達到最高，總黃酮提取率為12.77%，總多酚提取率為7.66%。出現這種情況的原因可能是因為隨著釀酒酵母接菌率的提高，發酵體系中的營養物質不能滿足釀酒酵母維持自身生長所需的能量，使得釀酒酵母活力降低，導致兩種成分的提取率下降。

圖2 接菌率對發酵液中總黃酮和總多酚提取率影響Fig.2 Effect of inoculation rate on extraction rate of total flavonoids and total polyphenols in fermentation broth

2.3 發酵時間對發酵液中總黃酮和總多酚提取率影響的分析

實驗考察了不同發酵時間對發酵液中總黃酮和總多酚提取率的影響，其結果如圖3所示。

圖3 發酵時間對發酵液中總黃酮和總多酚提取率影響Fig.3 Effects of fermentation time on extraction rates of total flavonoids and total polyphenols in fermentation broth

從圖3中看到，隨著發酵天數的增長，總黃酮的提取率先升高后降低，發酵時間為3 d時總黃酮提取率最高，達到12.65%。總多酚的提取率同樣在發酵3 d時最高，達到7.76%。隨著發酵天數的增長，總多酚提取率略有降低，推測是因為發酵3 d時釀酒酵母的生命活力最強，隨著發酵時間的增長，體系中的營養物質已不能滿足維持釀酒酵母自身生長所需的能量，使得釀酒酵母活力降低，導致兩種成分的提取率下降。

2.4 料液比對發酵液中總黃酮和總多酚提取率影響的分析

實驗考察了不通過料液比對發酵液中總黃酮和總多酚提取率的影響，其結果如圖4所示。

圖4 料液比對發酵液中總黃酮和總多酚提取率影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on extraction rates of total flavonoids and total polyphenols in fermentation broth

從圖4中看到，隨著料液比的增大，總黃酮的提取率先升高后降低，在料液比1∶2時，總黃酮提取率最高為11.63%，在料液比1∶1.5時，總多酚提取率最高為6.47%，兩種成分的提取率隨著料液比的增加，均有明顯的下降，可能是由于料液比變化，使得分子擴散速率改變，從而影響提取率。

3 結語

通過釀酒酵母發酵提取羅馬洋甘菊的研究，發現接菌率、發酵時間和料液比因素對發酵液的總黃酮和總多酚的提取率均有影響，其中發酵時間和料液比對提取率的影響較明顯。該研究為建立釀酒酵母發酵提取羅馬洋甘菊的工藝提供了基礎。