內酯類香料的微生物法轉化制備及其調控研究進展

田懷香，楊 睿，榮紹豐，于海燕，陳 臣

（上海應用技術大學香料香精化妝品學部，上海 201418）

內酯類化合物是羥基脂肪酸分子內羥基與羧基脫去一分子水形成的產物，由于羥基官能團的位置不同，可以分為β-內酯，γ-內酯，δ-內酯和大環內酯四類[1?2]。其中γ-內酯，δ-內酯天然存在于動植物中（如表1 所示），多體現花果香和奶香，嗅覺閾值普遍較低，故廣泛應用于糖果、飲料和糕點等食品中[3]。

表1 γ-癸內酯與δ-癸內酯Table 1 γ-Decalactone and δ-decalactone

內酯類香料的生產制備主要有化學合成、直接提取、微生物合成和微生物轉化四種方法。化學合成法原料易得、反應路徑短、產率高，但反應需特殊催化劑，且產物多為不具備立體選擇性的消旋體[4]。直接提取法設備簡單，操作方便，但其成本較高無法產業化生產不符合市場的需求多樣化。微生物合成法是指酵母菌和某些絲狀真菌在穩定期能合成次生代謝產物內酯，可以得到更為綠色和天然的異構體，但其合成過程不易控制。微生物轉化法具有高度化學專一性、位置專一性和立體專一性，可以大大簡化制造過程[5?6]。

近些年來，化學法合成香料的香氣品質愈發不能滿足消費者對于天然的追求，且天然提取香料的價格逐年攀升。微生物轉化法制備的芳香化合物具有與天然提取化合物相同的特定立體結構并表現出天然的特性，且其市場價格通常低于天然提取的化合物價格，所以微生物轉化法在制備內酯類化合物方面引起了科學界和產業界的廣泛關注[7?9]。基于此，本文在查閱相關文獻的基礎上，解析內酯類香料（主要是γ-癸內酯與δ-癸內酯）的微生物法轉化代謝機理和降解代謝途徑，綜述基因調控、溶氧氧合、底物分批培養、細胞固定化和菌種誘變等生物調控方法的研究進展，并對生物調控的未來研究方向和可能出現的問題進行展望，為微生物法制備芳香化合物提供理論參考。

1 生物轉化法代謝機理

在Okui 等[11]研究了幾種生物中的羥基化脂肪酸分解代謝后，利用微生物技術生產制備內酯類香料化合物的方式在60 年代開始出現。被用于生產內酯類香料的微生物主要有假畢赤酵母屬、單胞菌屬、假絲酵母屬、孢霉屬和紅酵母屬幾種，其中的解脂耶氏酵母是應用最為廣泛且產量較高的一種菌株。工業生產過程大多使用解脂耶氏酵母代謝蓖麻油酸底物，通過對其主要成分脂肪酸（約90%）進行線粒體轉運、β-氧化和縮合環化制備內酯類化合物[12?13]。現以蓖麻油酸為例介紹生物法轉化制備內酯類香料的主要生化過程。

1.1 油酸進入線粒體

其主要途徑包括以幾種脂肪酸或其衍生物為底物，在油酸轉運至線粒體時通過微生物細胞內特別是線粒體內一系列關鍵酶（酯酶和β-氧化酶系）的作用經四步β-氧化，把相應底物氧化為乙酰-CoA，后乙酰-CoA 進入循環徹底氧化，脫去碳原子單元，生成前體物質4-羥基酸[14]。由Waché等[15]的研究可知，脂肪酸進入線粒體進行β-氧化循環時，短式中長鏈脂酰-CoA 分子（十個碳原子以下）可以自由通過線粒體內膜，其中的脂酰-CoA 脫氫酶為其限速酶，而長鏈分子需要與極性肉堿結合后在其輔助下通過。脂肪酸進入線粒體共有如下幾種方式：一、在脂肪酸轉運蛋白的作用下進入線粒體；二、在脂肪酸移位酶的催化下以脂肪酸和脂肪酸結合蛋白結合物的形式進入；三、在酰基輔酶A 合成酶的催化下脂肪酸合成脂酰輔酶A，后在脂酰輔酶A 結合蛋白或肉堿棕櫚酰基轉移酶和肉堿/酰基肉堿移位酶的作用下進入[16?19]。

1.2 β-氧化過程

β-氧化是脂肪酸降解中經典的生化代謝路徑，也是一個碳鏈縮短的生物化學反應[20]。如圖1 所示，在脂酰-CoA 脫氫酶的作用下，每一輪β-氧化過程都會切下兩個碳原子單元即乙酰-CoA，然后乙酰CoA進入檸檬酸生產循環為細胞生物體生命活動提供所必需的能量。作為蓖麻油酸的十八碳化合物，其必須經過四步β-氧化循環后生成前體物4-羥基酸再進行環化形成內酯[21]。β-氧化過程包括以下四步反應：酰基輔酶A 氧化酶催化的氧化反應；烯酰輔酶A 氧化酶催化的水合反應；3-羥基輔酶A 脫氫酶催化的脫氫反應；3-酮酰-CoA 硫解酶催化的硫解反應[22]。

圖1 細胞中β-氧化生產內酯化合物的過程Fig.1 Production of lactone compounds by β-oxidation in cells

1.3 環化過程

內酯物質的環化過程是指羥基脂肪酸在環化酶的催化下通過分子內失去一分子水發生內酯化反應形成具有光學活性的環狀化合物的過程，并為微生物的生長繁殖提供必要的能量[1]。以γ-癸內酯的制備為例，其前體物質4-羥基癸酸在相應的脂肪酶和酯酶的催化作用下，其4 位碳原子上的羥基和1 位碳原子上的羧基脫水縮合環化生成[23]。在內酯環狀化合物中即使是非共軛的雙鍵也可以被選擇性的對映轉化。常見催化酶有酰基輔酶A 氧化酶和3-羥基酰輔酶A 脫氫酶等。

1.4 內酯的降解路徑

在利用蓖麻油酸生物轉化制備內酯時，當產物濃度達到一個最高值后由于細胞對內酯的降解或再利用，會出現緩慢減少的現象。產物內酯的降解可能主要有以下三種途徑：一是未內酯化的羥基酸降解速度比產物內酯的降解速度要快，這表明產物內酯的水解過程占主導控制地位。二是通過內酯酶的作用對產物內酯進行開環，后在β-氧化過程中將開環的產物進行氧化降解。三是產物內酯發生ω-氧化生成ω-二羧酸[24]。

2 生物轉化法調控

基于上述內酯的微生物轉化機理，研究者利用多種方法對菌株內酯的生物轉化進行調控，主要包括基因調控、誘變適宜菌種、改變轉化體系的溶氧水平、改變底物添加方式、及時分離菌株細胞來優化微生物體內的最適轉化制備反應條件等，最終達到提高微生物細胞內酯類化合物產量的目的（如表2 所示）。

表2 生物轉化法調控Table 2 Regulation by biological transformation

2.1 基于基因組學的基因調控

基于基因組學的基因調控是指基于基因組學技術，通過基因工程的方法從分子水平上對微生物進行操作，對其進行改造，敲除、擴增或添加某個基因片段，從而對微生物的相關理化性質及特征進行調控[30]。常被用來以微生物法轉化制備內酯類香料的解脂耶氏酵母具有六個酰基輔酶A 氧化酶家族—Aox1至6 由POX1至POX6基因編碼。在解脂耶氏酵母野生型菌株制備內酯的過程中，內酯的積累與Aox 的高效表達有關[24]。其中Aox2 表現出長鏈特異性，Aox3 表現出短鏈特異性，Aox4、Aox5 和Aox6在直鏈酰基輔酶A（從碳4 到碳18）的整個光譜中表現出弱活性[31]。

POX1基因的破壞導致β-氧化活性增加，但內酯的產量會減少。學者們通過對降解途徑中乙酰輔酶氧化酶Aox3 的編碼基因POX3片段的敲除，或者對具有羥基脂肪酸長鏈特異性的乙酰輔酶氧化酶Aox2 的編碼基因POX2的擴增表達，使所產內酯的生產回流和被基因編碼降解效應減弱，內酯的產量有了不同程度的提高[32?33]。馮春利等[34?35]利用同源重組和自克隆技術對POX3基因進行敲除，使得γ-癸內酯產量提高了2.73 倍。Zhang 等[25]通過敲掉POX3與GLT2片段構建工程菌，敲除POX3基因后內酯產量提高2.53 倍，GLT2敲除后的內酯產量提升1.31倍。Guo 等[36]通過POX2基因的擴增和POX3基因的破壞使得內酯產量提高了2.9 倍，除此之外對生產內酯起重要作用的Aox 酶進行了基因重組，促進了內酯產量提升。Braga 等[37]觀察到被破壞POX2-5基因和過表達Aox2p基因菌株的內酯產量減少（如表3 所示）。

表3 生物調控方式與相應內酯產量Table 3 Bioregulatory modalities and corresponding lactone production

研究表明，還可利用基因同源重組法對尿嘧啶關鍵合成酶基因URA3進行敲除，從而構建尿嘧啶營養缺陷型解脂耶氏酵母來大幅提升內酯產量。馮春利[35]以解脂耶氏酵母AS2.1045 為實驗菌株構建的尿嘧啶營養缺陷型菌株使γ-癸內酯的產量提高了4.18 倍。

2.2 菌種誘變

為選育高產內酯菌株，可采用誘變育種后再進行菌種篩選的方式。誘變育種按誘變因素可分為物理誘變和化學誘變。用化學或物理方法促進菌株細胞原生質體融合也是研究較多的一種菌種誘變育種方法，多種誘變因素一起誘變又稱為復合誘變。通過對菌株中特定控制4-羥基癸酰輔酶A 的羥基和-CoA 基團的內部酯化反應以及醇和酰基輔酶A 之間的酯化反應的酶基因進行突變，從而促進產物內酯的生產[38]。

Peng 等[10]對內酯生成過程中參與羥基化反應的醇酰基轉移酶PpAAT1 氨基酸殘基進行定點突變，使其更有效的催化4-羥基癸酰輔酶A 轉化前體物質4-羥基酸為γ-癸內酯，間接提升內酯化合物產量。徐勤[29]在桃子表面和桃樹林土壤中篩選出一株以蓖麻油為底物產γ-癸內酯的酵母菌J1，經過對其誘變育種和發酵條件優化，內酯產量達到2.98 g/L。通過對解脂耶氏酵母As2.1405 復合誘變及發酵條件優化等使γ-癸內酯的產量提高到2.04 g/L，此外蘇暢等[39]還對篩選獲得的酵母進行連續紫外誘變、NTG 誘變、DES 誘變和鈷60 誘變，使γ-癸內酯產量提高到1.44 g/L[40]。

2.3 溶氧氧合

氧氣傳質速率代表著生物轉化體系中的溶氧水平，氧氣傳質速率增加時，微生物的呼吸作用加強。因為微生物生長、β-氧化能力與產物內酯的形成相伴而生，所以溶氧濃度的增加和較好的培養基氧化狀態能夠有效提高菌株體內的β-氧化能力，從而提升菌株對底物的利用率[41?42]。通過在發酵前期常壓下增加曝氣速率和攪拌速率，以及提高反應器內的空氣壓力即增加氧溶解度，可以有效提高氣體到液體介質的氧傳遞速率，利于菌體生長[43]。而在產物生成期則降低速率進行分段控制，低溶氧量則有助于產物內酯的積累。因此通過調整溶氧進而調控內酯類香料的轉化程度在理論和實踐上是可行的[44]。

解脂耶氏酵母的β-氧化過程對培養基中溶氧濃度較為敏感，當氧氣超過一定濃度時，3-羥基酰輔酶A 脫氫酶在氧化過程中占主導作用，從而不利于細胞中內酯類化合物的產生[45]。氧氣濃度也影響著內酯類化合物的細胞內降解過程，較高氧氣濃度可以促進內酯類化合物向4-羥基酸的轉化。因此為提高內酯化合物產率，應在產物內酯濃度較高時降低培養基中的氧氣濃度[42]。

Try 等[46]以絲瓜海綿為固體支持物，在強制通氣的微型反應器中酵母細胞出現高產γ-癸內酯現象。Braga 等[37]發現在低氧化速率，較高的溶氧濃度下，γ-癸內酯的產量提高到了5.4 g/L；并采用增加氣動力為攪拌動力的生物反應器中空氣壓力的方法，提高微生物細胞培養物的充氧，從而增加氧在介質中的溶解度，更有利于內酯的轉化[43]。Gomes 等[45]通過提升培養基中溶解氧濃度至44.4%使得內酯產量達到680.9 mg/L，并在改變曝氣程度及攪拌速度的條件下提高了內酯類化合物的轉化速率。Lopes 等[26]研究證明了改善氧合可以提高細胞特定的生長速度，呈現高生物量生產力。Reis 等[47]使用一種基于空氣振蕩的小型生物反應器生產γ-癸內酯，通過提高體系中的氧氣傳質速率，使達到最大內酯產量的時間縮短一半。

2.4 底物分批培養

在菌株發酵培養幾個小時后底物完全耗盡，酵母細胞以γ-癸內酯為碳源消耗。因此，γ-癸內酯從培養基中完全消失，從而產物內酯生產率取決于增長率和消耗率之間的差異。底物分批培養可以作為其解決方法，當底物低于菌株消耗利用所需水平時，底物被間歇或連續地供應從而減緩了產物內酯的消耗率提升了內酯產量。不同種底物（如蓖麻油和蓖麻油酸甲酯）的添加方式影響著微生物法轉化制備γ-癸內酯的產量，當通過底物分批進料培養發酵時內酯類香料的產量會有所提升[48]。

Moradi 等[49]的研究表明純氧曝氣補料分批發酵獲得的內酯化合物最高濃度是分批發酵的3 倍。Nelma 等[27]通過間歇式分批補料發酵培養使內酯化合物產量提高了3 倍，同時副產物3-羥基-γ-癸內酯的產量增加，提高了底物的利用效率。閆淑芳等[50]通過底物的二次加入培養實現了產物內酯的濃度提升。Andrade 等[7]研究解脂耶氏酵母CCMA 0242菌株在體積分數為30%的蓖麻油作為底物分批培養時體現出較好的產內酯效果。Rong 等[51]在以釀酒酵母培養蓖麻油酸產生內酯時，通過向培養基中添加左旋肉堿來提高底物的利用率，加速了脂肪酸的消耗，生物轉化周期縮短。并通過向培養基中分別加入γ-己內酯、γ-辛內酯和γ-十二內酯來緩解產物內酯在生物轉化過程將要結束時易被酵母細胞降解的現象。結果表明γ-辛內酯競爭性地抑制了產物內酯與內酯降解酶的結合，使得γ-癸內酯的產量有效增加了11%。

2.5 細胞固定化技術

限制生物制備內酯類香料工業化應用的另一主要因素是菌株細胞對內酯化合物濃度的升高較為敏感且產物內酯對菌株細胞具有一定的毒害作用。微生物細胞的固定化技術已被證實能為細胞提供一定的保護作用，通過將產物內酯與菌株細胞分離使其免受物理化學變化或抑制物質的影響[50]。降低產物內酯對菌株的毒害作用及菌株對產物內酯的降解作用，并提高底物的利用率，加快發酵速度，延長細胞的活性和穩定性，從而提高菌株的內酯產量[28]。

研究表明，因為產物內酯對菌株細胞存在一定的毒害作用，所以微生物細胞在生物技術生產過程中細胞活性受到了影響。當內酯化合物濃度高于150 mg/L 時細胞生長易被抑制，細胞去極性化，膜流動性增加[41]。Aguedo 等[42]通過添加如石蠟油等疏水吸附劑來原位捕獲內酯，以此維持酵母細胞的良好體系。一些研究者為此設計了反應分離耦合工藝，產物內酯與酵母可以進行有效分離，進而有效緩解了內酯化合物的毒害作用，間接提升內酯的產量。Alchihab 等[52]使用Macronet 樹脂從生物轉化培養基中以80%的吸附率吸附去除γ-癸內酯。于偉等[28]通過添加大孔樹脂AB-8 吸附產物γ-癸內酯，將產物內酯與酵母細胞進行分離，使產物的生產速率提高了36%、產量達到2.17 g/L。Zhao 等[53]將解脂耶氏酵母G3-3.21 固定在海藻酸鈉和凹凸棒石的混合物上，循環利用酵母并以離子液體作為共溶劑轉化蓖麻油生產γ-癸內酯，使內酯產量提高了2.5 倍，產物濃度達到8.05 g/L[54?55]。此外，Mohamed 等[52]在生產γ-癸內酯的過程中通過添加天然膠使內酯的產量達到6.52 g/L。

2.6 增加細胞疏水性

解脂耶氏酵母細胞顯現出親水性，當細胞接觸水分子時細胞對疏水性表面或分子具有良好的吸引力。底物蓖麻油酸作為疏水性介質，不利于酵母細胞的微生物利用轉化。在解脂耶氏酵母細胞以蓖麻油為底物轉化制備內酯類化合物過程中細胞表面與底物的小液滴之間發生直接接觸，通過選擇具有親和力的表面活性劑—陽離子表面活性劑，可以增加細胞與底物間的接觸程度[1]。或通過向反應體系中添加有利于疏水性底物蓖麻油酸溶解的極性有機溶劑，從而改善底物蓖麻油酸的分散性并有利于提升酵母細胞的底物傳質速率及利用率[56]。

Gomes 等[57]研究了細胞疏水性在細胞轉化制備γ-癸內酯過程中所起到的作用。在內酯類化合物生產中使用疏水性更強的細胞可以增加底物親和力，從而增加細胞對底物的吸收程度，間接提高了產物內酯的生產率。Escamilla-Garcia 等[44]提出在高通氣率下細胞的疏水性會逐漸增加的觀點。通過向體系中添加具有親和力的陽離子表面活性劑或是增加疏水性底物溶解性的極性有機溶劑等方法，有利于改善菌株細胞的膜的通透性從而提升菌株細胞的底物利用率，進而增加內酯類化合物的產量。

3 總結和展望

生物法制備的內酯類香料屬于天然香料，深受消費者喜愛，具有較強的市場競爭力。本文綜述了內酯類物質的微生物法轉化制備和降解代謝途徑，包括微生物細胞內脂肪酸進入線粒體的不同種方式和發生的β-氧化過程。對目前已有的生物轉化法調控方式如基于基因組學的基因調控、溶氧氧合、底物分批培養、細胞固定化、菌種誘變等進行了總結，展望了內酯類香料的調控研究方向。

但目前的生物轉化法制備工藝存在一些缺陷和不足，如產率不理想、成本高和操作復雜等，限制了其工業化生產規模和應用水平。未來可深入研究菌株細胞中控制β-氧化過程的基因片段、不同種微生物調控研究方法的限制條件和內酯化合物生成過程中參與羥基化反應的醇酰基轉移酶的關鍵基因控制位點。隨著生物法制備技術的不斷發展，對內酯類香料的生物法制備需要更進一步的認知研究，這對天然香料的高效生物制備具有重要意義。