姜黃素-牛血清白蛋白復合物對牦牛乳干酪品質的影響

張 巖，陳煉紅 ，張 莉

（1.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川成都 610041；2.西南民族大學食品科學與技術學院，四川成都 610041；3.四川省食品發酵工業研究設計院有限公司，四川成都 611130）

干酪是一種以牛乳或羊乳為原料，在發酵劑與凝乳酶作用下使乳中酪蛋白凝固并排出乳清，再經過一段時間成熟而制成的發酵乳制品[1?2]。原料乳中干物質的含量是影響干酪得率的重要指標之一，研究顯示牦牛乳營養豐富，風味獨特，其干物質約為17.31%、乳脂為6.49%、乳蛋白為5.01%，均高于中國荷斯坦牛，理論上更適合作為干酪的優質原料[3?5]。然而，受到青藏高原特殊環境的制約及生產技術的限制，牦牛乳產品開發長期處于初級階段，在市場上只能見到少量的牦牛乳粉和牦牛酸乳產品[6]。因此，制作牦牛干酪是拓展牦牛產業發展、助力鄉村振興戰略的路徑之一。

干酪的氧化變質是制約產品保質期的重要因素，干酪產品在儲存、運輸和零售過程中，會發生氧化反應從而導致異味產生[7?9]。因此，采取相應的措施來阻止氧化的發生是目前迫切需要解決的問題，但抗氧化劑、產品組成和加工之間的平衡成為挑戰。當抗氧化劑在機體內發揮作用時，易于被過量產生的活性氧所淹沒，從而發生氧化應激，其中細胞和細胞外大分子（蛋白質、脂質和核酸）可能遭受氧化損傷，進而導致組織損傷[10]。為了克服此問題，已經嘗試使用天然食物中的抗氧化活性成分來對抗此類組織傷害。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的天然親脂性抗氧化劑，與一般的合成抗氧化劑相比，姜黃素安全無毒，且具有抗炎、抗菌、抗癌以及抗氧化等生物活性[11?12]。研究表明姜黃素包封于載體中可有效提升其生物利用度以及溶解性[13?14]，能夠有效改善其水溶性差、化學不穩定性和低生物利用度等制約因素，在食品工業中具有廣闊的應用前景。因此，本實驗采用納米技術制備姜黃素-牛血清白蛋白復合物，作為抗氧化物質應用于牦牛乳干酪制作中，研究其對牦牛干酪成熟過程品質性能的影響，為改善牦牛乳干酪抗氧化能力提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮牦牛乳 四川省紅原縣哈拉瑪村麥洼牦牛（乳密度：1.031 g/cm3；滴定酸度18 °T；乳蛋白含量4.81%；乳脂含量6.79%）；菌種TCC-3、小牛皺胃酶（酶活力1400 CU/g） 科漢森有限公司；姜黃素（98%） 南京景竹生物科技有限公司；牛血清白蛋白美國Sigma 公司；營養瓊脂固體培養基/MRS 固體培養基 青島海博生物科技有限公司；硫代巴比妥酸、二甲基亞砜、氫氧化鉀等試劑 均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

SKD-08S2 紅外石英消化爐 上海沛歐分析儀器有限公司；MP512-02 精密pH 計 德國Matthaus公司；SKD-800 凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；DHG-9203A 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；PL303 分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司；KQ-500E 型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃素-牛血清白蛋白復合物制備 參照張鵬等[11]使用反溶劑沉淀-超聲輔助法制作姜黃素-牛血清白蛋白復合物顆粒。將姜黃素溶于二甲基亞砜形成有機相，牛血清白蛋白溶于水中形成水相，以有機相與水相體積之比為1:20 將有機相于超聲過程中注入水相中，姜黃素與牛血清白蛋白用量之比為3:2。混合液置于冰浴條件下超聲處理（800 W，超聲時間3 s，間歇2 s）5 min 得到姜黃素-牛血清白蛋白復合物納米溶液，加入保護劑混勻后于?80 ℃預凍18 h，然后快速置于凍干機中冷凍干燥48 h，即可得到姜黃素-牛血清白蛋白復合物納米粒。

1.2.2 牦牛乳新鮮干酪加工工藝 生鮮牦牛乳→標準化→巴氏殺菌→冷卻→發酵→添加氯化鈣→添加凝乳酶→凝乳→切割→攪拌→堆釀→排乳清→添加姜黃素-牛血清白蛋白復合物→壓榨成型→鹽漬→切塊→成熟→成品。

操作要點：生鮮牦牛乳經過濾、檢驗、標準化后置于68 ℃殺菌30 min，殺菌后的牦牛乳冷卻至32 ℃時添加一定量的發酵劑進行發酵。當發酵至pH 為6.1 左右時分別添加0.02%的氯化鈣與0.003%的凝乳酶，靜置保溫凝乳。當凝乳形成后，將凝乳塊切割為1 cm3的小塊，適當升溫利于乳清析出，分別取2%、4%、6%、8%姜黃素-牛血清白蛋白復合物加入乳酪凝塊中攪拌混勻，裝入模具進行壓榨后放入15%的鹽水溶液中浸漬8 h，最終將干酪真空包裝放于10 ℃條件下成熟[6]，以未添加姜黃素-牛血清白蛋白復合物的干酪作為空白對照組。

1.2.3 檢測方法

1.2.3.1 營養指標測定 水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量測定分別依據 GB/T 5009.3-2016、GB/T 5009.4-2016、GB/T 5009.5-2016、GB/T 5009.6-2016[15?18]。

1.2.3.2 微生物指標測定 參照GB 4789.2-2016、GB 4789.35-2016 測定細菌總數以及乳酸菌數[19?20]。取25 g 干酪樣品切碎置于存有225 mL 滅菌生理鹽水的錐形瓶中，搖勻后得到10?1的樣品稀釋液，依次進行10 倍的倍比稀釋，分別從每個梯度的稀釋液中吸取200 μL 樣品溶液，將其均勻涂布于營養瓊脂固體培養基/MRS 固體培養基平板上，置于37 ℃條件下培養36～48 h，取30～300 之間菌落數的平板進行計數。

1.2.3.3 pH 測定 將干酪與蒸餾水1:1（質量比）混合，采用pH 計直接測定法[21]。

1.2.3.4 蛋白質分解指標測定 依據李昂等[22]方法測定pH4.6 醋酸鹽緩沖液可溶性氮（SN-pH4.6）含量及12%三氯乙酸溶液可溶性氮（12%TCA-SN）含量。

1.2.3.5 脂肪分解指標測定 依據李昂等[22]的方法測定硫代巴比妥酸反應物（TBARS）及酸價。

1.2.3.6 感官檢測 取牦牛乳干酪樣品通過“三角測試”方式提供給20 位有經驗的食品專業人員，根據表1 提供的感官評分標準進行評分[21]。

表1 干酪感官品評標準Table 1 Sensory evaluation criteria for cheese

1.3 數據處理

利用Excel 對數據進行整理，采用SPSS 軟件Duncan 檢驗對試驗數據進行方差分析（ANOVA），定義5%作為差異顯著性的水平（P＜0.05）。所有試驗重復三次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪營養成分的影響

測定干酪成熟過程中營養成分的變化可以了解干酪的成熟狀況，結果如表2～表5 所示。姜黃素-牛血清白蛋白復合物的存在能夠顯著提升干酪中的水分與蛋白質含量（P＜0.05），水分含量增加主要是由于復合物中具有親水基團，能夠結合水分填充在酪蛋白網狀構造之間，而蛋白質含量增加則歸因于復合物中載體蛋白作出的貢獻，復合物添加量越高[22]，干酪中增加的蛋白質含量越多。在干酪成熟期間，牦牛乳干酪中水分、蛋白質以及脂肪的含量均呈顯著下降趨勢（P＜0.05），說明蛋白質與脂肪在乳酸菌與凝乳酶的共同作用下被分解，導致干酪酪蛋白網狀結構松散，部分可溶性營養成分隨著水分析出。然而，灰分呈現上升趨勢，這是由于無機鹽成分在酪蛋白網狀結構的固著作用下損失較少[22]。

表2 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪水分的影響Table 2 The effect of curcumin-BSA complex on the moisture of cheese

表3 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪灰分的影響Table 3 The effect of curcumin-BSA complex on the ash of cheese

表4 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪蛋白質含量的影響Table 4 The effect of curcumin-BSA complex on the protein of cheese

表5 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪脂肪含量的影響Table 5 The effect of curcumin-BSA complex on the fat of cheese

2.2 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪微生物指標的影響

2.2.1 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪乳酸菌的影響 乳酸菌的生長繁殖會直接影響牦牛乳干酪產品的風味、質構等性狀，是重要的監測指標之一。姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪乳酸菌的影響如圖1 所示，添加姜黃素-牛血清白蛋白復合物的干酪中乳酸菌含量顯著高于對照組（P＜0.05），這表明復合物具有一定的益生性能，有助于干酪成熟過程中乳酸菌的增殖生長。特別是，在復合物添加量為4%時，乳酸菌含量最高，而添加量過高，對乳酸菌的益生效果逐漸減弱，但在成熟過程中添加姜黃素-牛血清白蛋白復合物的干酪中乳酸菌含量始終高于對照組。

圖1 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪乳酸菌的影響Fig.1 The effect of curcumin-BSA complex on the content of lactic acid bacteria in cheese

2.2.2 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪菌落總數的影響 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪菌落總數的影響結果見圖2。所有實驗組干酪在成熟過程中細菌總數呈下降趨勢。與對照組相比，添加姜黃素-牛血清白蛋白復合物干酪中細菌總數顯著降低（P＜0.05）。這歸因于姜黃素本身是一種酚類物質，具有抑制有害細菌以及霉菌生長的功能，與牛血清白蛋白結合形成納米顆粒后仍然保持生理活性，從而顯著抑制雜菌的生長繁殖（P＜0.05），保障牦牛乳干酪成熟過程環境的穩定。

圖2 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪菌落總數的影響Fig.2 The effect of curcumin-BSA complex on the total number of colonies in cheese

2.3 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪pH 變化的影響

干酪產品的色澤、口感、風味以及穩定性方面離不開pH 的貢獻，姜黃素-牛血清白蛋白復合物添加量對干酪pH 變化的影響結果如圖3 所示。在牦牛乳干酪成熟過程中，pH 均呈先下降后趨于平穩的趨勢，而添加姜黃素-牛血清白蛋白復合物使干酪pH下降的速度顯著增快（P＜0.05），當復合物添加量為4%時，pH 下降速度最快。據報道，由于乳酸菌以及凝乳酶的存在，在干酪成熟初期，乳糖以及脂肪成分會分解產生乳酸、脂肪酸成分，導致pH 下降，而在成熟后期，干酪中的糖分分解完全不再繼續提供乳酸，同時蛋白質水解產生的堿性小分子有機物也會中和一部分游離的H+，導致干酪的pH 不再繼續下降[23]。另外，添加復合物能夠促進乳酸菌繁殖生長，加速干酪中乳酸以及脂肪酸的形成，導致干酪pH 下降的速度增快，而當姜黃素-牛血清白蛋白復合物添加量大于4%時，復合物益生效果下降，因此降低乳酸以及脂肪酸形成的速率，這與2.2.1 中獲得的結果相一致。

圖3 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪pH 變化的影響Fig.3 The effect of curcumin-BSA complex on the pH value of cheese

2.4 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪蛋白分解指標的影響

2.4.1 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪中SN-pH4.6含量的影響 SN-pH4.6 含量是評價干酪成熟度的重要指標之一，能夠體現出干酪蛋白被乳酸菌、凝乳酶分解出的小肽和中肽的含量。如圖4 所示，姜黃素-牛血清白蛋白復合物的添加顯著提高可溶性氮含量，在復合物添加量為4%時更為顯著（P＜0.05），這歸因于復合物能提升乳酸菌分解蛋白質的效率，同時復合物包封的載體蛋白質在成熟過程中也會被分解形成可溶性氮，大大提升了SN-pH4.6 含量。此外，觀察到隨著干酪成熟天數的增加，SN-pH4.6 含量總體呈上升逐漸趨于平緩的趨勢。這是由于在成熟初期，乳酸菌濃度不高，發酵程度不足，蛋白質分解能力差，而隨成熟時間延長，乳酸菌數量上升且具有較高的活力，可以迅速將干酪中的酪蛋白水解成小肽。當干酪達到一定成熟度后，乳酸菌與凝乳酶的活力減退，蛋白質水解速度下降，同時部分中肽和小肽也會被繼續分解形成游離氨基酸[24]，因此SN-pH4.6 增加的速度明顯減緩。

圖4 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪中SN-pH4.6的影響Fig.4 The effect of curcumin-BSA complex on SN-pH4.6 in cheese

2.4.2 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪中12%TCASN 含量的影響 測定12%TCA-SN 含量是評估干酪中催化水解酪蛋白產生的小分子肽以及游離氨基酸含量的重要技術手段，可以客觀反映出干酪成熟度情況。由圖5 可知，在干酪成熟過程中，12%TCASN 含量一直呈上升趨勢，但在發酵初期12%TCASN 增加緩慢，歸因于發酵初期干酪蛋白初步分解產生中間產物中肽及小肽，而隨著發酵時間延長，雖然乳酸菌與凝乳酶活力下降，但部分乳酸菌開始自溶并釋放出細胞酶，進一步將初期分解的中肽等中間產物繼續分解為小肽及游離氨基酸，因此12%TCA-SN含量快速增加。在整個發酵過程中，試驗組中12%TCA-SN 含量顯著高于對照組，主要是由于復合物中載體蛋白質成分被分解也提供一些可溶性氮成分，且添加復合物制作的干酪中乳酸菌數量與活性也優于對照組，導致蛋白水解量增加，產生大量的小分子肽及游離氨基酸。

圖5 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪中12%TCA-SN 的影響Fig.5 The effect of curcumin-BSA complex on 12%TCA-SN in cheese

2.5 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪脂肪分解指標的影響

2.5.1 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪酸價的影響 酸價體現了干酪中脂肪分解出游離脂肪酸總量，通過測定酸價的變化可以評價乳脂肪分解程度。由圖6 可知，在干酪成熟過程中，酸價逐漸升高且趨于平緩，主要是由于在干酪成熟初期，乳酸菌與酶類對干酪中脂肪分解強度較大，產生大量游離脂肪酸，導致酸價快速上升，而成熟后期，乳酸菌與凝乳酶逐漸失去活力，干酪中脂肪分解受到限制，因此酸價上升趨勢減緩。在整個發酵過程中，添加姜黃素-牛血清白蛋白復合物使干酪中酸價顯著高于對照組（P＜0.05），說明復合物的存在能增加乳酸菌分解脂肪的能力，有利于游離脂肪酸的形成。

圖6 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪酸價的影響Fig.6 The effect of curcumin-BSA complex on acid value of cheese

牦牛乳干酪中的脂肪會在成熟過程中被乳酸菌與酶類分解，產生醇類、酯類、醛類以及游離脂肪酸等風味物質，共同作用下呈現出獨特的風味[25]，因此脂肪的分解程度能夠直接影響牦牛乳干酪的口感、風味以及質地。研究顯示，國外大部分干酪因脂肪分解產生大量的風味物質而形成濃烈的風味，其酸價高達8.8～9.6 mg/g[26]，這對于國內消費者是較難接受的。值得注意的是，本研究中牦牛乳干酪酸價保持在5.0～6.5 mg/g 范圍內，整體低于國外大部分干酪，表明此干酪中脂肪分解程度有限，干酪風味相對柔和，易于被國內消費者接受。

2.5.2 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪TBARS的影響 乳制品中的脂肪特別是不飽和脂肪酸，化學分子結構含有雙鍵，化學性質活潑，易被氧化，從而導致不良的風味、質地和營養價值喪失。脂肪自動氧化的主要初期產物氫過氧化物很不穩定，容易降解為醛類、酮類、醇類、酯類等有機化合物，因其能夠與硫代巴比妥酸生成有色物質，可通過測定TBARS 值反映脂肪的氧化程度。干酪成熟過程中TBARS 值變化情況如圖7 所示，TBARS 值隨著成熟時間的延長而快速上升，主要是脂肪氧化的結果，尤其在成熟后期干酪中脂肪被分解為游離脂肪酸等分子量較小的成分，更加容易與氧氣接觸，氧化程度增加。與對照組相比，添加姜黃素-牛血清白蛋白復合物制作的干酪中TBARS 值顯著降低（P＜0.05），說明復合物能有效抑制脂肪氧化，而且抑制效果隨著復合物添加量的增加而增強，這主要由姜黃素貢獻，加載在牛血清白蛋白納米粒子中的姜黃素的穩定性得以改善，仍然保留酚羥基的抗氧化活性，能夠有效抑制脂肪氧化。

圖7 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪TBARS 的影響Fig.7 The effect of curcumin-BSA complex on TBARS in cheese

2.6 姜黃素-牛血清白蛋白復合物對干酪感官的影響

姜黃素-牛血清白蛋白復合物會影響干酪色澤以及成熟過程中風味的形成，感官評定是牦牛乳干酪產品品質的直觀體現，干酪的感官評分結果如圖8 所示。所有體系中干酪感官評分隨著發酵時間的增長呈先上升后下降的整體趨勢，而添加姜黃素-牛血清白蛋白復合物的干酪感官評分高于對照組，且復合物添加量為4%，成熟時間為60 d 時，感官評分顯著高于其他處理組（P＜0.05）。姜黃素-牛血清白蛋白復合物的添加會顯著改善干酪色澤（P＜0.05），使干酪黃度增加，但是添加量超過4%時導致干酪色澤呈黃色，影響感官評分。此外，姜黃素-牛血清白蛋白復合物的添加能夠改善干酪內的菌落組成[27?28]，有益于風味物質的形成，提高其感官評分，而成熟60 d 后，干酪中的部分蛋白質分解成苦味小肽，脂肪分解形成大量的風味物質，造成干酪風味過于濃烈且苦感增強，同時蛋白質分解引起干酪內部穩定的網狀結構受到破壞[29]，組織狀態變差，影響感官評分，這與前面實驗結果相一致。

圖8 牦牛乳干酪感官評分Fig.8 Sensory score of yak milk cheese

3 結論

本實驗以川西北高原地區牦牛乳為原料生產牦牛干酪，探究基于牛血清白蛋白構建包封姜黃素的納米復合物可作為提高牦牛乳干酪成熟品質的潛在應用價值。結果表明姜黃素-牛血清白蛋白納米復合物的存在能夠顯著提升牦牛乳干酪的水分與蛋白質含量（P＜0.05），還能促進乳酸菌的增殖并抑制雜菌生長，有助于牦牛乳干酪中脂肪與蛋白質的分解，形成短鏈脂肪酸和多肽，呈現較好的獨特風味；而復合物添加量過高會減弱益生效果，降低脂肪和蛋白分解效率，同時也引起干酪色澤發黃而降低感官評分。在成熟過程初期，感官評分顯著提升（P＜0.05）得益于蛋白質水解反應以及脂肪分解反應的發生，但成熟期過長會導致苦味小肽等物質的堆積，形成不良風味，影響感官品質。綜上所述，姜黃素-牛血清白蛋白復合物添加量為4%，成熟時間為60 d 時，干酪產品品質最佳，為天然抗氧化成分提高干酪成熟過程品質性能應用技術提供理論支撐。