酶輔助堿法提取龍眼核淀粉的結構與理化性質研究

藍緒悅，王 玲，杜沁嶺，徐 文，代乾貴，賈冬英

（四川大學輕工科學與工程學院，四川成都 610065）

龍眼核約占龍眼果實鮮重的20%左右，含有淀粉、膳食纖維、蛋白質等營養成分以及多糖、多酚等活性成分，其中淀粉含量最高，約占龍眼核干重的60%，故龍眼核是一種良好的淀粉資源[1?2]。

目前，有關龍眼核的研究主要集中在其活性成分的提取及藥理作用方面，關于龍眼核淀粉的研究較少且不夠深入。彭小燕等[3]采用高速剪切輔助堿法提取龍眼核淀粉，確定了最佳提取工藝，但未對淀粉性質進行研究。Hu 等[4]采用濕法提取儲良、石硤和草鋪3 種龍眼核淀粉，并比較了其結構、糊化和消化特性。李秀娟等[5]采用傳統堿法提取龍眼核淀粉，并以玉米淀粉和馬鈴薯淀粉為參照比較了其粒徑及溶解度等特性，對其理化及結構特性的研究較為局限。

龍眼核中含6%左右的蛋白質，研究表明蛋白質易與淀粉結合形成致密結構，同時淀粉顆粒與蛋白質間存在的靜電作用、疏水作用及氫鍵等也會影響淀粉的提取，酶輔助堿法提取的淀粉具有完整光滑的結構，堿性蛋白酶的加入能進一步降低淀粉中的蛋白質殘留，提高淀粉得率及純度[6]。此外，不同的淀粉提取方法也會影響淀粉的性質，基于此，本文采用蛋白酶輔助堿法提取龍眼核中的淀粉，以常見的谷類玉米淀粉和豆類豌豆淀粉為參比，分析其化學組成、結構及理化性質，以期獲得更全面的龍眼核淀粉特性及對其高附加值利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍眼核粉 將新鮮龍眼核洗凈后于45 ℃烘干后粉碎、過40 目篩；玉米淀粉和豌豆淀粉 均為市售食用級產品；堿性蛋白酶（200 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；直鏈淀粉標準品 中國水稻研究所；溴化鉀、無水乙醚、無水乙醇 成都市科隆化學品有限公司。

Multiskan GO 型酶標儀 美國賽默飛公司；UV6000PC 型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；IRTracer-100 傅立葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；LA-960 型激光粒度儀 日本HORIBA；JSM-7500F 型場發射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；EMPYREAN 型X 射線衍射儀 荷蘭帕納科公司；DSC214 型差示量熱掃描儀 德國NETZESCH公司；RVA-Super3 型快速黏度分析儀 澳大利亞NEWPORT 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 龍眼核淀粉的制備 參考傅新征[7]的方法并稍作改進，稱取一定量的龍眼核粉，按料液比1:12加入pH9 的氫氧化鈉溶液，混勻后加入堿性蛋白酶（300 U/mL），40 ℃下振蕩提取3 h，以200 目濾布過濾后用蒸餾水沖洗殘渣3 次，合并濾液，混勻后于4000 r/min 離心10 min，除去所得沉淀表層的棕色物質，再用蒸餾水洗滌沉淀多次后離心（4000 r/min 離心10 min），收集沉淀，用適量無水乙醚浸泡脫脂3 h 后用85%乙醇洗滌3 次[8]，將所得淀粉于40 ℃烘干后過100 目篩。

1.2.2 龍眼核淀粉的化學組成分析 水分含量測定參照GB 5009.3-2016 中的直接干燥法；粗脂肪含量測定參照GB 5009.6-2016 中的索氏抽提法；粗蛋白含量測定參照GB 5009.5-2016 中的凱氏定氮法；灰分測定參照GB 5009.4-2016 食品中總灰分的測定方法；總淀粉含量測定參照GB5009.9-2016 中的酶水解法；直鏈淀粉含量測定參照碘結合法，得到直鏈淀粉標準曲線擬合方程y=153.41x?12.119（R2=0.9996）。

1.2.3 龍眼核淀粉結構分析

1.2.3.1 粒徑測定 采用激光粒度儀對龍眼核淀粉粒徑分布進行測定。將適量淀粉懸濁液滴加于分散槽中，以超純水為分散劑，超聲分散1 min。

1.2.3.2 微觀結構分析 采用掃描電子顯微鏡觀察龍眼核淀粉的微觀結構。將少量龍眼核淀粉固定在樣品臺上，對其截面噴金后觀察。放大倍率為500倍和2000 倍，加速加壓為15 kV。

1.2.3.3 晶體結構分析 采用X 射線衍射儀對龍眼核淀粉晶體結構進行測定。X 射線源為Cu-Kα射線，管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描速率5 °/min，步長0.02°，掃描范圍4～70°。

1.2.3.4 紅外光譜分析 將3 mg 龍眼核淀粉與450 mg KBr 混合均勻后壓片，采用傅立葉紅外光譜儀在400～4000 cm?1范圍對其進行掃描，分辨率2 cm?1，掃描次數12 次。

1.2.4 龍眼核淀粉理化特性測定 在以下實驗中選擇豌豆淀粉和玉米淀粉作為對照樣品。

1.2.4.1 透明度測定 參照孔露等[9]的方法并稍作修改。將1 g 龍眼核淀粉放入100 mL 蒸餾水中，沸水浴中攪拌糊化30 min，期間補水以保持原質量，冷卻至室溫后放置72 h，期間每隔12 h 搖勻后于620 nm 測定透光率，以蒸餾水為對照。

1.2.4.2 溶解度與膨潤力測定 參照姚月華等[10]的方法并略作改進。將0.5 g（m）烘干至恒重的龍眼核淀粉放入40 mL 蒸餾水中振蕩1 min，分別于50、60、70、80 ℃和90 ℃水浴下保持30 min，冷卻至室溫后在4000 r/min 下離心10 min，將所得上清液于105 ℃烘干至恒重，所得干燥物質量記為m1，將離心管中沉淀物的質量記為m2，按照以下公式計算龍眼核淀粉的溶解度和膨潤力。

1.2.4.3 熱力學特性測定 采用差示掃描量熱儀（DSC）測定龍眼核淀粉的熱力學性質。參照Mapengo等[11]的方法對測試條件稍作調整。稱取約2.5 mg龍眼核淀粉于坩堝中，加入7.5 mg 蒸餾水，壓緊坩堝后室溫下平衡24 h，以空白坩堝作對照。測定程序為升溫速率10 ℃/min，氮氣流速20 mL/min，升溫范圍20～170 ℃。

1.2.4.4 糊化特性測定 參考Liu 等[12]的方法稍作修改。將3 g 龍眼核淀粉放入裝有25 mL 超純水的RVA 專用鋁盒中，混勻后置于RVA 儀測定。測定程序為：前10 s 攪拌速度為960 r/min，后降至160 r/min 保持。起始溫度為50 ℃，維持1 min 后以12 ℃/min 的速度升溫至95 ℃，保持3 min，再以12 ℃/min 的速度降溫至50 ℃，保持2 min。

1.3 數據處理

所有實驗均重復三次，數據按平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0 軟件對結果進行統計分析，采用OriginPro8.5 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 龍眼核淀粉的化學組成

龍眼核淀粉的化學組成見表1。可以看出，龍眼核淀粉含有較高的總淀粉、直鏈淀粉及水分，較低的粗蛋白、粗脂肪和灰分。其直鏈淀粉含量高于李秀娟等[5]和Guo 等[13]的研究結果，二者分別為20.5%和30.1%，這可能是由于選用的桂圓品種與提取方法不同。其粗蛋白含量明顯低于彭小燕等[3]分別采用高速剪切輔助堿法和傳統堿法提取的龍眼核淀粉，二者分別為4.24%和3.76%，說明添加堿性蛋白酶能有效分解龍眼核中的蛋白質，降低淀粉中的蛋白質含量。

2.2 龍眼核淀粉的顆粒形態與結構特性

2.2.1 龍眼核淀粉的粒徑分布與顆粒形貌 龍眼核淀粉顆粒粒徑見表2。可以看出，3 種淀粉顆粒粒徑間存在顯著差異，其中龍眼核淀粉的粒徑最小。小顆粒淀粉具有良好的流動性、填充性和反應活性，因此龍眼核淀粉在生物降解塑料、脂肪替代物、化妝品等領域顯示出良好的應用前景[14]。

表2 龍眼核淀粉顆粒的粒徑Table 2 Size of longan kernel starch granules

龍眼核淀粉的顆粒形態如圖1 所示。可以看出，龍眼核淀粉顆粒多呈橢圓形或不規則多邊形，表面較光滑，僅少許淀粉顆粒表面存在裂紋，這與Hu等[4]和李秀娟等[5]的研究結果一致，說明堿性蛋白酶的加入未對淀粉結構造成不良影響。

圖1 龍眼核淀粉的掃描電鏡圖（500×和2000×）Fig.1 Scanning electron micrograph of longan kernel starch(500× and 2000×)

2.2.2 龍眼核淀粉的晶體結構 淀粉微晶大小的差異使其在X 衍射曲線上表現出不同衍射特征，據此可將淀粉分為A、B 和C 型3 種晶型結構[15]。龍眼核淀粉的晶體結構如圖2 所示。可以看出，龍眼核淀粉在15°、17°、18°和23°附近有較強的衍射峰，符合常見于谷物淀粉的A 型晶體結構[16]，這與Hu 等[4]的研究結果一致。通過對衍射峰及基線間衍射強度積分，得到龍眼核淀粉的相對結晶度為27.8%，該值與Hu 等[4]報道的石硤龍眼核淀粉的相對結晶度接近（28.6%）。

圖2 龍眼核淀粉的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction pattern of longan kernel starch

2.2.3 龍眼核淀粉的紅外吸收光譜 龍眼核淀粉的紅外吸收光譜如圖3 所示。可以看出，3 種淀粉的紅外光譜大體相似，龍眼核淀粉的化學鍵類型和其他兩種淀粉基本相同，但在含量上存在一些差異。龍眼核淀粉在3000～3700 cm?1處存在寬帶特征吸收峰可能是己糖環上的O-H 伸縮振動峰，說明其中存在分子內和分子間的氫鍵[17]。龍眼核淀粉在此位置的吸收峰與豌豆淀粉及玉米淀粉相比有一定偏移，可能是因為三者分子間和分子內氫鍵的強度及比例存在差異[18]。2928 cm?1附近的吸收峰是C-H 鍵的不對稱伸縮振動吸收峰；1641 cm?1處為淀粉中水分子的δ（O-H）彎曲振動吸收峰；1157 cm?1附近為C-C、CO 伸縮振動吸收峰；1082 cm?1處的吸收峰代表了淀粉分子中的C-O-H 彎曲，也可表示淀粉中的非晶態[19?21]，三種淀粉在此4 個吸收峰下的波數無明顯差異，但在1019 cm?1處龍眼核淀粉的C-O 伸縮振動吸收峰的波數與玉米淀粉和豌豆淀粉相差較大，這主要是受淀粉儲存時間的影響[22]。

圖3 龍眼核淀粉的紅外吸收光譜Fig.3 Infrared absorption spectrum of longan kernel starch

此外，淀粉在1045、1022 cm?1和995 cm?1處的峰值可以反映其晶體、非晶體結構及水合碳水化合物的螺旋結構[23]，因此常用（1045/1022）cm?1及（1022/995）cm?1的峰強度比值表征淀粉分子的近程有序結構，（1045/1022）cm?1值越大，（1022/995）cm?1值越小，淀粉的近程有序度越高[24]。龍眼核淀粉紅外光譜共振峰相對強度比值見表3。可以看出，3 種淀粉中，龍眼核淀粉的（1045/1022）cm?1值低于玉米淀粉，但高于豌豆淀粉；其（1022/995）cm?1比值稍高于玉米淀粉，但接近于豌豆淀粉，說明龍眼核淀粉的近程有序程度略低于玉米淀粉，但高于豌豆淀粉。

表3 龍眼核淀粉的共振峰相對強度比值Table 3 Relative intensity ratios of resonance peak of longan kernel starch

2.3 龍眼核淀粉的理化特性

2.3.1 淀粉糊的透明度 透光率可表征淀粉糊的透明度；透光率越高，則淀粉糊的透明度越高[25]。1%龍眼核淀粉糊的透光率隨著放置時間的變化如圖4所示。可以看出，隨放置時間的延長，3 種淀粉糊的透明度均呈緩慢下降趨勢，室溫下放置60 h 后龍眼核淀粉糊的透明度與豌豆淀粉接近，透光率為3.81%；3 種淀粉糊中，豌豆淀粉糊的透光率最大，龍眼核淀粉糊次之，玉米淀粉糊的透光率最小，這與淀粉顆粒大小及直鏈淀粉聚集和重結晶等均有關。龍眼核淀粉透明度較低可能因為其顆粒較小、結構緊湊，易對光線產生反射或折射[26?27]。

圖4 龍眼核淀粉的透光率Fig.4 Light transmittance of longan kernel starch

2.3.2 溶解度與膨潤力 溶解度和膨潤力可反映淀粉在加熱過程中的變化，對其在食品中的應用具有重要意義。龍眼核淀粉的溶解度隨溫度的變化如圖5（a）所示。可以看出，3 種淀粉中，豌豆淀粉的溶解度最大，龍眼核淀粉次之，玉米淀粉的溶解度最小，這是由于玉米淀粉較高的支鏈淀粉含量會阻礙淀粉分子的溶出，從而降低其溶解度[28]。三者溶解度均隨溫度升高而增大，龍眼核淀粉的溶解度從50 ℃的3.5%上升至90 ℃的11.26%，這與李秀娟等[5]的結果相似，究其原因可能是溫度超過70 ℃后龍眼核淀粉開始糊化，使得水分子進入淀粉的結晶區，淀粉顆粒膨脹崩解，顆粒內的淀粉分子大量溶出使其溶解度上升[10]。

圖5 不同溫度下龍眼核淀粉的溶解度（a）與膨潤力（b）Fig.5 Solubility (a) and swelling power (b) of longan kernel starch at different temperatures

由圖5（b）可知，3 種淀粉的膨潤力均隨溫度的升高而增大；60 ℃之前膨潤力基本一致，玉米淀粉和豌豆淀粉的膨潤力在60 ℃后明顯上升，龍眼核淀粉的膨潤力在70 ℃后才快速增加，并在80 ℃后超過玉米淀粉和豌豆淀粉，最終達到15.93%。這可能是因為龍眼核淀粉分子間氫鍵在較高溫度下才發生斷裂，之后水分子加速滲入淀粉分子中，使得淀粉快速膨脹而糊化。該結果中膨潤力值低于李秀娟等[5]報道的結果，這可能是由于本研究提取的龍眼核淀粉直鏈淀粉含量高于李秀娟等的結果，直鏈淀粉與支鏈淀粉相互纏結，抑制了淀粉的膨脹[29]。

2.3.3 熱力學特性 淀粉糊化過程常伴隨著支鏈淀粉雙螺旋從半結晶結構解離成無定形構象以及部分直鏈淀粉的溶出。3 種淀粉糊化的起始溫度（T0）、峰值溫度（Tp）、結束溫度（Tc）和糊化焓（ΔH）見表4。可以看出，3 種淀粉的熱力學特性存在顯著差異（P＜0.05），其中龍眼核淀粉的糊化溫度和糊化焓最高，說明其凝膠化起始所需的能量最大，且其雙螺旋結構更為緊密。3 種淀粉糊化溫度的差異可能是其顆粒形態、晶體結構、直鏈淀粉含量、淀粉的分子結構等存在差異導致的，研究表明淀粉糊化溫度和焓變與直鏈淀粉含量呈負相關，B 型結晶度比A 型結晶度更易糊化，小顆粒淀粉比大顆粒淀粉具有更高的糊化溫度[30?32]。本研究中龍眼核淀粉的T0和Tc與Guo等[13]DSC 法測定的結果接近，明顯高于李秀娟等[5]采用偏光十字法測得的結果，這可能是二者的測定方法及直鏈淀粉含量的不同。

2.3.4 糊化特性 糊化特性是淀粉特性的重要指標之一，可以反映淀粉懸浮液在加熱及冷卻過程中的黏度變化。3 種淀粉的糊化參數見表5。可以看出，3種淀粉中，龍眼核淀粉的糊化溫度為76.45 ℃，接近于玉米淀粉，明顯高于豌豆淀粉（P＜0.05），表明其顆粒結構更為緊密，淀粉分子間存在更強的結合力，使得其能更強地抵抗溶脹和破裂，因此不易糊化。該結果與表4 存在差異是因為測定方法及淀粉濃度不同。錢建亞等[33]研究顯示，DSC 法測定的淀粉糊化溫度明顯低于RVA 法。除糊化溫度外，3 種淀粉其它糊化參數均存在顯著差異（P＜0.05），這可能是因為這些淀粉的顆粒大小、顆粒內部分子排列、直鏈淀粉含量等不同[34?36]。龍眼核淀粉較高的峰值黏度可能與其高直鏈淀粉含量和高溫下較高的溶脹力有關。崩解值可以表征淀粉的熱糊穩定性；崩解值越小表明熱糊穩定性越好。龍眼核淀粉的崩解值顯著高于豌豆淀粉和玉米淀粉，說明龍眼核淀粉的熱糊穩定性較差[37]。回生值可以表征淀粉的冷糊穩定性，其值越小表明冷糊穩定性越好[38]，龍眼核淀粉的回生值明顯低于豌豆淀粉，說明其冷糊穩定性優于豌豆淀粉。此研究結果中峰值黏度、谷值黏度、最終黏度、崩解值和回生值均明顯高于Guo 等[13]的研究，這可能由于本研究中龍眼核淀粉含有更多的直鏈淀粉。

表4 龍眼核淀粉的熱力學特性Table 4 Thermal parameters of longan kernel starch

表5 龍眼核淀粉的糊化特性參數Table 5 Gelatinization characteristic parameters of longan kernel starch

3 結論

本文中采用酶輔助堿法提取龍眼核淀粉，分析了其化學組成、理化及結構特性。龍眼核淀粉含有較高的直鏈淀粉，其顆粒呈橢圓形或不規則多邊形，表面較為光滑，少許顆粒表面有裂紋及孔洞。龍眼核淀粉具有小粒徑、A 型結晶結構和較高的近程有序度，其透明度較低且隨放置時間的增加而緩慢下降，溶解度隨溫度增加而平穩上升，膨潤力在70 ℃后迅速增加。龍眼核淀粉較難糊化，擁有較高的糊化溫度和糊化焓，熱糊穩定性較差，冷糊穩定性較好。本研究表明酶輔助堿法提取的龍眼核淀粉相較于其他提取方法可明顯減少淀粉中的蛋白質殘留，且對淀粉結構未造成不良影響，理化性質上存在一定差異，這為龍眼核淀粉在食品中的應用研究提供了支撐。