米蛋白-海藻酸鈉互穿網絡水凝膠的制備及性能表征

蘇 丹，楊 楊，范 婧，邊 鑫，王 冰，劉琳琳，張鐵男，馬春敏，張 娜

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150028）

大米是許多國家的主食，占世界糧食能源供應的20%[1]，碎米是指在快速干燥、過度干燥等過程產生裂紋，從而導致研磨過程中破碎了的米粒，其長度尺寸小于全谷物的?[2]。與精米或二等精米相比，碎米的價格更為低廉[3]。碎米中約含有8%～10%的蛋白質，米蛋白營養價值豐富，其賴氨酸含量為3%～4%，是谷物蛋白質中含量最高的蛋白質之一[2]。大米也因低致敏性的特點而受到人們的廣泛關注。碎米蛋白在食品加工（如米豆腐）中最重要的功能特性之一是其加熱時的凝膠特性，這顯著影響產品的質構和感官特性。然而，天然碎米蛋白的膠凝性能非常差，并且通常易受加工條件的影響。因此，為了提高碎米蛋白在食品加工中的應用，有必要改善其凝膠特性。據報道，與其他成分（如脂肪、淀粉、多糖、水膠體和其他非蛋白質添加劑）的相互作用是提高蛋白質凝膠特性的有效方法[4]。海藻酸鈉（SA）是一種由α-L-葡萄糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸通過隨機排列連接而成的高分子多糖[5]，常被用于制備食品凝膠，而廣泛應用于食品和生物醫學領域[6]。Ca2+與SA 的α-L-古洛糖醛酸鈉（G 塊）交聯形成“蛋盒”結構，從而形成凝膠網絡[7?8]。Sun 等[9]也提出通過離子交聯海藻酸鈉可形成力學性能較高的水凝膠。

水凝膠是一類具有三維親水網絡結構的材料，由親水性的交聯聚合物鏈制成[10]。有研究提出，具有較高力學性能的食品級硬水凝膠更適于應對人造肉制品、可食用包裝膜的挑戰，并具有延長胃駐留藥物的潛力[11?12]。因此，為拓展水凝膠在食品領域中的應用，關于增強水凝膠力學性能的方法研究具有較大意義。近年來，互穿聚合物網絡（IPN）水凝膠作為增強生物聚合物凝膠的力學性能的新手段引起了研究者的廣泛關注。IPN 是由兩個或多個網絡組成的聚合物，這些網絡在分子尺度上至少部分交錯，但彼此之間不共價鍵合[13?14]。可食用的IPN 水凝膠通常使用天然多糖和/或蛋白質制備。Wen 等[15]采用酶和離子交聯的方法制備了明膠-海藻酸鹽互穿聚合物網絡（IPN）結構的新型生物聚合物水凝膠，利用流變和力學試驗發現IPN 水凝膠的力學性能有顯著提高。Wang 等[16]通過熱處理和漆酶誘導制備了米谷蛋白-甜菜果膠形成復合凝膠，發現IPN 水凝膠比單純的米谷蛋白具有更高的的流變性、結構性能和保水能力。因此，與單一材料水凝膠相比，復合材料制備的IPN 水凝膠表現出更高的凝膠強度和物理穩定性[14]。

因此，在本研究中，Ca2+離子交聯SA 網絡被用作IPN 水凝膠中的剛性網絡，將碎米蛋白進行熱處理，蛋白熱聚集形成柔性網絡，以增強力學性能。通過熱處理和離子交聯法制備具有互穿網絡結構的高機械強度RP-SA IPN 水凝膠，考察了RP 濃度對水凝膠質構性能、流變性能、溶脹性能等特性的影響。以期為后續更多的高力學性能食品級水凝膠制備及應用開發提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碎米 黑龍江省五常金禾米業有限公司；海藻酸鈉、氯化鈣 食品級，河南糖柜食品有限公司（中國河南）；其他試劑均為分析純。

JA2003N 電子分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；HH-4D 數顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司；SHA-GS 雙功能水浴恒溫振蕩器杭州旌斐儀器科技有限公司；H-PTD20 流變儀 奧地利安東帕有限公司；NMI20 核磁共振成像儀 上海紐曼電子科技有限公司；SCIENTZ-12N 冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；IsensoTA new pluse 質構儀 上海瑞芬國際貿易有限公司；JXFM110錘式旋風磨 上海嘉定糧油儀器有限公司；CM-700D 色差儀 日本柯尼卡美能達。

1.2 實驗方法

1.2.1 碎米蛋白的提取 參考趙卿宇等[17]的方法，并稍作修改。將碎米進行打磨粉碎，過80 目篩，得到碎米粉。將所得碎米粉以1:4（g/mL）的料液比加入正己烷，室溫下以170 r/min 振蕩4 h，靜置1 h，除去上清液，風干后得到脫脂米粉。

取一定量的脫脂米粉，以1:10（g/mL）的料液比添加蒸餾水，攪拌2 h，于4000 r/min 下離心15 min，收集沉淀，重復上述操作1 次。將收集的上清液用2 mol/L HCl 調至pH4.6，靜置沉淀1 h 后，于4000 r/min下離心15 min，蒸餾水清洗沉淀3 遍，調至pH7.0，將所得碎米蛋白沉淀冷凍干燥，備用。

1.2.2 米蛋白-海藻酸鈉IPN 水凝膠的制備 參考Niu 等[8]的方法制備水凝膠，并稍作修改。將一定量的碎米蛋白粉溶于去離子水中，pH 調節至9.0，攪拌過夜，以確保蛋白質完全溶解，從而獲得80、100、120、140、160 mg/mL 的米蛋白儲備溶液。取10 mL 相應的米蛋白溶液于50 mL 燒杯中，隨后加入一定量的海藻酸鈉粉末，于50 ℃下攪拌溶解，使得最終獲得的混合溶液中海藻酸鈉最終濃度為15 mg/mL。將混合溶液于90 ℃加熱30 min，將等體積10 mL的氯化鈣溶液（1%（w/v））加入到熱處理后的溶膠中，170 r/min 室溫振蕩4 h，用去離子水洗去未交聯的鈣離子，制備的水凝膠在4 ℃的冰箱中保存24 h，以便進一步測定。

1.2.3 色差的測定 水凝膠的色差參考Niu 等[18]的方法進行測定。使用色差儀對制備的水凝膠進行拍照測定，記錄L*（亮度）、a*（紅色）和b*（黃色），根據以下公式計算水凝膠的白度。

1.2.4 凝膠硬度的測定 水凝膠的凝膠硬度參考Wu 等[19]的方法測定。使用P0.5 探頭，壓縮比為50%，測前、測試及測后速率均為1.0 mm/s，觸發力5.0 g，兩次測定時間間隔為3 s，每個處理組重復3 次。

1.2.5 流變特性的測定 水凝膠的動態流變特性測定參考Zhong 等[20]的方法。使用型號為PP50 的平板進行測量，將水凝膠放置在流變儀板之間，首先進行應變相關測量以獲得RP-SA IPN 水凝膠的線性粘彈性區域。應變相關測量后，進行頻率相關測量。然后在小的恒定應變（1.0%）下測量動態流變特性，該應變在所有樣品的線性區域內，在25 ℃下進行了從0.1～10 Hz 的動態頻率掃描，將儲能模量（G'）和損耗模量（G''）記錄為頻率的函數。

1.2.6 溶脹性的測定 參照任艷艷[21]的方法對凍干后的水凝膠樣品溶脹性進行測定。溶脹試驗在25 ℃下進行，將每個已知重量的凍干樣品浸在去離子水中，直到達到絕對水合作用。每次取樣時，取出凝膠樣品，吸附表面液后記錄。溶脹率（swelling ratio，SR）的計算公式如下：

式中：m2水凝膠冷凍干燥切塊后的重量，g；m1水凝膠浸泡后并吸干表面多余液體后的重量，g。

1.2.7 低場核磁（LF-NMR）的測定 水凝膠水分分布的測定參考余永名等[22]的方法。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列進行自旋-自旋弛豫時間（T2）的測定，將制備好的水凝膠裝入核磁測試管中，置于永久磁場射頻線圈的中心進行核磁分析。并進行磁共振成像，偽彩圖分析，樣品的顏色從藍色到黃色再到紅色代表水分含量的逐步遞增。

1.3 數據處理

每組實驗重復3 次，使用Origin 2018 軟件進行分析和繪圖。采用SPSS 20 軟件對實驗數據進行單因素方差分析，以P＜0.05 為顯著性差異，結果用平均值±標準差（D）表示。

2 結果與分析

2.1 RP-SA IPN 水凝膠的外觀形態及色差比較

研究碎米蛋白的濃度分別為80、100、120、140、160 mg/mL 的條件下，RP-SA IPN 水凝膠的宏觀形成。由圖1 可以看出，在碎米蛋白濃度為80 mg/mL時RP-SA IPN 水凝膠表面不均勻，但隨著碎米的蛋白濃度的增加，凝膠表面變得平滑，160 mg/mL 濃度下的RP-SA IPN 水凝膠質地更為堅硬且具有彈性。這是由于隨著米蛋白濃度的增加，參與反應的物質會越來越多，因此形成的交聯網絡也會增加，凝膠內部結構變得致密，這些說明了水凝膠的外觀形態的差異。

圖1 不同碎米蛋白濃度下的RP-SA IPN 水凝膠的凝膠形態Fig.1 Gel morphology of RP-SA IPN hydrogels at different broken rice protein concentrations

顏色是決定產品應用和消費者可接受性的重要因素，也是解釋凝膠形態的重要參數，因此，考察了RP-SA IPN 水凝膠樣品的L*、a*、b*和白度值。其中，L*一般指明度指數，a*和b*決定樣品顏色的色調和飽和度，白度值與光在水凝膠中的散色有關，RPSA IPN 水凝膠的白度值主要取決于凝膠網絡中蛋白和/或聚合程度以及其表面的光學特性[22]。

RP-SA IPN 水凝膠的白度呈現在圖2B 中，米谷蛋白濃度為160 mg/mL 時的RP-SA IPN 水凝白度最高為76.45，米谷蛋白的加入對RP-SA IPN 水凝膠的外觀形態雖然有一定的影響，但影響較弱，隨著RP 濃度的逐漸增高，白度變化幅度較小，但蛋白濃度為160 mg/mL 時的水凝膠白度值較80 mg/mL 濃度下的水凝膠白度值有較顯著的提高（P＜0.05）。一方面，這可能是高濃度的碎米蛋白溶液在堿性環境與加熱條件下呈現乳白色導致的。另一方面，水凝膠白度變化主要與水凝膠內部網絡交聯和鍵的形成有關，在協同作用條件下水凝膠形成致密結構[23]。在聚合物鏈之間形成大量的接合區，這可能會產生散射光的晶體區域[24]。但當凝膠網絡形成較少的交聯和較少的填充系統時，光散射能力降低[23]。因此，高濃度碎米蛋白的RP-SA IPN 水凝膠的凝膠網絡更加致密，能反射更多的光從而使得白度增加，這也與Kang 等[25]的研究結果相似。

圖2 不同碎米蛋白濃度對RP-SA IPN 水凝膠色差的影響Fig.2 Effect of different broken rice protein concentrations on chromat difference of RP-SA IPN hydrogels

2.2 RP-SA IPN 水凝膠的凝膠硬度

水凝膠的凝膠硬度是用來衡量水凝膠力學性能的常用手段，它表示完成形變所需要的力的大小。由圖3 可以看出，米蛋白濃度可顯著影響RP-SA IPN 水凝膠的凝膠硬度（P＜0.05）。Ca2+離子交聯SA 形成的凝膠網絡被用作IPN 水凝膠中的剛性網絡，碎米蛋白在熱處理后，蛋白發生熱聚集而形成的凝膠網絡作為柔性網絡，從而增強了水凝膠的凝膠強度，因此，在80 mg/mL 的碎米蛋白濃度下就有較大的凝膠硬度（958.48 gf）。隨著碎米蛋白的濃度的增大，水凝膠的硬度也逐漸增加，并在140 mg/mL 的碎米蛋白濃度后，水凝膠的硬度增加趨勢變得較為平緩。這可能是由于含高濃度蛋白的混合溶液中分子間碰撞交聯的幾率逐漸增加，發生了更多的互連，形成了更多的凝膠網絡結點和更精細的結構，穩定性更強，凝膠硬度更大[26]。另一個可能的原因是隨著碎米蛋白的增加，碎米蛋白和海藻酸鈉之間的靜電相互作用增加，導致耦合網絡的密度增加，從而使RG-IPN 水凝膠凝膠硬度增大，力學性能增強[27]。

圖3 不同碎米蛋白濃度對RP-SA IPN 水凝膠凝膠硬度的影響Fig.3 Effect of different broken rice protein concentrations on gel hardness of RP-SA IPN hydrogels

2.3 RP-SA IPN 水凝膠的流變特性

在現有水凝膠的研究中，動態流變學數據可以作為評估凝膠化以及凝膠形成的能力之一，反映了復合水凝膠的相關理化性質[28]，因此，通過對RP-SA IPN 水凝膠流變學行為的研究分析，確定其有著廣泛的應用前景。系統中大分子的結構形成可以通過動態測量確定粘彈性來解釋，其中彈性由儲能模量G'表示，而粘性由損耗模量G"解釋[29]。在圖4 所示的G'，G"與頻率的關系中，隨著頻率的增加，大多數水凝膠的模量值增加。在整個頻率范圍內，所有水凝膠的G'值都是G"值的3～5 倍，表明所有水凝膠都具有穩定的結構和良好的粘彈性，RP-SA IPN 水凝膠的儲存模量（G'）和損耗模量（G"）與頻率的關系也表明了水凝膠具有固體狀特征[30]。水凝膠中連接區的結構和數量是水凝膠力學性能的決定因素，RP-SA IPN 水凝膠的連接區由米蛋白凝膠鏈和海藻酸鈉凝膠鏈形成，隨著碎米蛋白濃度的增加，水凝膠結構中米蛋白凝膠鏈的增多，儲能模量G′的平衡值從3488.8 增加到5511.2 Pa，水凝膠的力學性能不斷提高。這也意味著可以通過改變米蛋白的濃度來調節水凝膠的流變特性，以獲得更多基于米蛋白的水凝膠。

圖4 不同碎米蛋白濃度對RP-SA IPN 水凝膠的儲存模量G'（A）和損失模量G"（B）的影響Fig.4 Effect of different broken rice protein concentrations on the storage modulus G' (A) and loss modulus G" (B) of the RPSA IPN hydrogels

2.4 RP-SA IPN 水凝膠的溶脹特性

水凝膠的溶脹特性對于水凝膠的應用有著重要的意義[31]，溶脹率可以揭示凝膠體系中聚合物-聚合物和聚合物-溶劑的相互作用，反映IPN 水凝膠的力學性能。水凝膠的溶脹能力與凝膠網絡中的交聯程度和水凝膠的力學性能成反比。圖5 描述了不同碎米蛋白濃度對RP-SA IPN 水凝膠溶脹率的影響。從圖中可以看出，大部分RP-SA IPN 水凝膠在180 min后，溶脹率基本保持不變，水凝膠達到溶脹平衡；前60 min 內水凝膠的吸水速率很快，并且隨著RP-SA IPN 水凝膠體系中碎米蛋白濃度的增加，溶脹率從約11.51 下降到約3.64，下降了約3 倍多。與低濃度碎米蛋白的RP-SA IPN 水凝膠相比，高蛋白濃度的IPN 水凝膠的溶脹率一般較低，這是由于凝膠體系中蛋白濃度的增加，疏水基團與親水基團的比例較高，熱處理蛋白發生熱聚集后，在凝膠體系中構建的網絡越多，水凝膠的結構越緊湊，水分子穿透的自由體積越小，膨脹速率越低[32]，這也是力學性能增加的原因。

圖5 不同碎米蛋白濃度對RP-SA IPN 水凝膠的溶脹性的影響Fig.5 Effects of different broken rice protein concentrations on swelling properties of RP-SA IPN hydrogels

2.5 RP-SA IPN 水凝膠的水分分布

低場核磁LF-NMR 主要通過橫向弛豫時間來反映水凝膠中不同狀態水分的遷移規律。橫向馳豫時間分布圖中橫坐標為橫向馳豫時間，可以表征水凝膠中水的流動性，縱坐標是信號強度（質子密度），表示對應馳豫時間下的水分含量。橫向弛豫時間中1～10 ms 為T2b，代表了凝膠中的強結合水；10～100 ms為T21，代表了凝膠中的弱結合水；100～1000 ms 為T22，代表了凝膠中的不易流動水；1000～10000 ms為T23，代表了凝膠中的自由水[32]。由圖6 可見，在1～10000 ms 的弛豫時間內不同碎米蛋白濃度的水凝膠中水分分布的變化有3 個峰，分別代表強結合水、不易流動水和自由水，可以看出提高RP-SA IPN 水凝膠中碎米蛋白濃度后，水凝膠的馳豫時間變短，說明凝膠體系中的結合水碎米蛋白或海藻酸鈉基團結合緊密，水分受到的束縛程度增強，凝膠的網絡結構更緊密[33]。一般而言，凝膠的馳豫時間與水分子受到的束縛程度成反比，水的自由度越高，則測定時馳豫時間越長。而弛豫時間T2越短，水與底物結合越緊密，保水性越好；弛豫時間T2越長，水與底物的結合越松散，水分子越自由，保水性也越差[34?35]。

圖6 不同濃度碎米蛋白對RP-SA IPN 水凝膠低場核磁共振弛豫時間（T2）分布的影響Fig.6 Effect of different concentrations of broken rice protein on the distribution of low-field NMR relaxation times (T2) of the RP-SA IPN hydrogels

由圖7 可以看出碎米蛋白的濃度為80 mg/mL時，形成的凝膠其水分分布不均勻，局部顏色很亮（偽彩圖中越紅），在米蛋白濃度較低時，熱處理形成的蛋白凝膠，凝膠網絡較松散，在體系內無法相互纏繞，僅起到填充作用，從而導致形成的水凝膠網絡結構比較松散，致使水的流動性更強，水分分布不均勻。而隨著IPN 水凝膠中碎米蛋白濃度增加，偽彩圖中紅色區域逐漸減少，說明水分分布較為均勻，水的流動性降低，凝膠網絡較為致密[25]。

圖7 不同濃度碎米蛋白的RP-SA IPN 水凝膠水分分布的偽彩圖Fig.7 Pseud-plot of water distribution of RP-SA IPN hydrogels at different concentrations of broken rice protein

3 結論

通過對RP-SA IPN 水凝膠的制備及性能研究，碎米蛋白濃度的改變對于水凝膠外在色度的影響較小，這對于它在食品中的應用而言，少了形態色度的限制。碎米蛋白濃度的增加可以改善水凝膠的外觀形態，使制備的水凝膠外表更加平滑，并且顯著提高了RP-SA IPN 水凝膠的儲能模量和損耗模量，改善了水凝膠的質構性能，促進自由水向不易流動水的轉變。在米蛋白濃度為140 mg/mL 時，彈性模量和凝膠強度的增長趨勢較為平緩，米蛋白濃度為160 mg/mL時，流變性能和質構性能最佳。此外，在較低蛋白濃度下的RP-SA IPN 水凝膠具有較高的溶脹率，但其保水性也較差，隨著蛋白濃度的提高，水凝膠的溶脹率降低，保水性提高，水分分布也較為均勻。綜上所述，改變碎米蛋白濃度對IPN 水凝膠特性有著積極作用，而由于RP-SA IPN 水凝膠具有優良的力學性能和溶脹性能，所形成的水凝膠對食品工業具有非常重要的意義，它可以為碎米蛋白凝膠在具有更高要求的新型食品應用中提供一定的理論基礎。