普魯蘭酶酶解對葛根淀粉理化特性的影響

莫 琰，楊尚威，趙 燦，劉傳菊，豁銀強，張 倩，湯尚文,

（1.湖北文理學院食品科學技術學院，湖北襄陽 441053；2.襄陽市農業科學院，湖北襄陽 441057）

葛根是國家衛生部首批批準的藥食同源兩用植 物，具有多種生理活性，包括抗氧化、抗腫瘤和抗誘變等特性，有助于預防骨質疏松癥、心血管疾病、癌癥、肝纖維化、高血壓和高血糖等[1]。葛根經挑選、清洗、去皮、切片、護色、干燥、粉碎等工藝可制取葛根全粉或葛根淀粉[2]，輔以其它原料（親水膠體、蛋白和淀粉類等）后可加工成功能性飲料[3]、固體飲料[4]、代餐粉[5]、面條[6]等產品。其中，沖調型固體飲料，因制備工藝簡單，設備投資低，且產品市場接受程度高，成為眾多中小葛根加工企業的主流產品。

葛根淀粉是葛根固體飲料最主要的成分，其由20%～22%直鏈淀粉和78%～80%支鏈淀粉組成[7]，支鏈淀粉分子量約107～109Da，平均鏈長約20.5 DP，其鏈長分布和內部結構對淀粉的溶解、糊化、凝膠、消化等特性均有較大影響[8]。直接采用天然葛根淀粉生產的固體飲料存在沖調時易結塊、溶解性差等問題，因此，有研究人員采用α-淀粉酶、糖化酶和普魯蘭酶等酶法改性改善飲料的沖調性、穩定性和口感[9?10]。現有酶法改性葛根淀粉工藝的共同點在于，均需先將葛根淀粉加熱糊化后再降溫至合適的酶解溫度以加強酶的作用。這類工藝又帶來兩個新的問題。首先，糊化酶解后葛根淀粉的溶解性雖有提升，但糊化液干燥后再進行沖調時黏度大幅度下降影響飲用體驗，需要額外添加親水膠體等輔料進行增稠[11]；其次，酶解后的淀粉糊液需要采用噴霧干燥等技術去除水分[12]，增加了設備投資和工藝難度。為避免上述問題，趙凱等[13]在低于糊化溫度（35～50 ℃）下采用普魯蘭酶對玉米淀粉進行脫支改性，制備顆粒態慢消化淀粉（SDS），研究發現，雖然未糊化條件下普魯蘭酶作用時間較長（6～14 h），但其依然對淀粉的結晶特性、熱焓特性、顆粒形貌等產生了顯著的影響，且顆粒態SDS 后處理過程中脫水、干燥及粉碎等操作相對簡便。LI 等采用分支酶在低溫（50 ℃）且未糊化條件下對葛根淀粉進行改性，結果表明葛根淀粉的直鏈淀粉含量、分子量、結晶特性、流變特性等均有顯著變化。上述研究表明，在低溫且未糊化條件下對淀粉進行酶法改性是可行的，且改性后仍然保持顆粒狀態的淀粉更有利于進行分離、干燥等后處理。

現有研究采用的各種酶中，普魯蘭酶可定向水解支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵，減小淀粉的分支化度，增加直鏈淀粉含量，同時還對淀粉的消化特性有較大影響，其對淀粉的酶解作用相對α-淀粉酶和糖化酶更為緩慢和溫和。因此，本文采用普魯蘭酶對未經糊化的顆粒態葛根淀粉進行酶解，考察其對葛根淀粉理化特性的影響，以期為葛根固體飲料的生產提供部分參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根淀粉（食品級） 湖北葛百歲葛業有限公司；普魯蘭酶（10000 U/g，食品級） 嘉源食品配料有限公司；α-淀粉酶（3000～5000 U/g，BR） 北京雙旋微生物培養基制品廠；胃蛋白酶（3000 U/g，BR）、葡萄糖淀粉酶（80000 U/g，BR） 合肥博美生物科技有限公司；其它化學試劑均為分析純，水為超純水。

UV-2600 紫外分光光度計、IR2000 傅里葉紅外光譜儀 日本島津；RVA-Tec Master 快速黏度分析儀 瑞典波通；AQ20 差示掃描量熱儀 美國TA；DM2700P 偏光顯微鏡 德國萊卡；Mastersizer3000激光粒度儀 英國馬爾文；D8 Advance X-射線衍射儀 德國布魯克；S-4800 掃描電鏡 日本日立。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根淀粉的酶解 通過預實驗結合已有研究文獻[14?17]，確定葛根淀粉酶解工藝為：稱取50 g葛根淀粉，添加500 mL 純水于恒溫水浴中攪拌分散，緩慢滴加用1 mol/L HCl 調整pH 至5.5，添加0.25 g 普魯蘭酶，在50 ℃下攪拌酶解18 h，之后在4000 r/min 下離心20 min，離心后所得沉淀用純水洗滌、離心（條件同上），直至上清液為中性，取沉淀50 ℃干燥至恒重，碾缽研磨后過100 目篩網于干燥皿中保存備用。葛根淀粉和酶解葛根淀粉分別標記為KS 和EHKS。

1.2.2 糊化特性的測定 配制10%（干基質量）的淀粉懸浮液置于RVA 測量鋁桶內，用攪拌槳上下攪拌均勻后，迅速上機測試。測定條件：開始10 s 內攪拌轉速960 r/min，之后攪拌轉速160 r/min；在50 ℃保持1 min，隨后以12 ℃/min 的速度勻速升溫至95 ℃，在95 ℃保持2.5 min 后以12 ℃/min 勻速降溫至50 ℃，在50 ℃保持2 min。

1.2.3 抗性淀粉含量測定 參考張煥新[18]的方法，采用Goni 法并略作改動測定抗性淀粉含量。淀粉試樣經胃蛋白酶水解去除蛋白，之后采用α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶充分水解，加入無水乙醇離心后所得絮狀沉淀即為抗性淀粉（RS）。RS 用KOH 溶解后加入葡萄糖淀粉酶充分水解成葡萄糖，水解液經離心取上清液用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量。抗性淀粉含量按下式計算：

式中，RS（%）為抗性淀粉含量；S（g）為上清液中還原糖總量；0.9 為轉換系數；M（g）為試樣質量。

1.2.4 DSC 測定 稱取5 mg 樣品于DSC 專用鋁盒中，添加15 μL 的蒸餾水后密封，室溫放置2 h 后以空鋁盒作參照，進行DSC 測定。升溫速率為5 ℃/min，吹掃氮氣為50 mL/min，溫度掃描范圍為30～120 ℃。

1.2.5 微觀結構觀察 偏光顯微鏡：用蒸餾水分散樣品，涂抹在載玻片上，蓋上蓋玻片后置于偏光顯微鏡下觀察，調整并固定光源，目鏡10×、物鏡50×下進行觀察，得到偏光顯微圖。

掃描電鏡：將適量樣品均勻涂抹在雙面導電膠上，用離子濺射儀噴金，置于掃描電子顯微鏡中，在不同放大倍數下觀察葛根淀粉的表觀形貌，加速電壓5.0 kV。

1.2.6 粒度分布測定 將樣品用純水配制成質量分數為1%的懸浮液，充分震蕩混勻上機測試。遮光度范圍設置為5%～20%，分析模型選用球型模型。

1.2.7 紅外光譜測定 取2 mg 待檢測樣品與200 mg KBr 于研缽中混合研磨均勻后采用壓片機壓片。測試模式為Absorption；掃描波段4000～400 cm?1；分辨率4 cm?1；樣品掃描32 次。

1.2.8 XRD 測定 操作電壓40 kV，電流30 mA，以Cu 作為靶。分別取酶解前后葛根淀粉少許置于樣品架上，掃描速率10°/min，收集衍射角2θ在5～45°范圍的衍射數據，得到XRD 圖譜。

1.3 數據處理

RVA、DSC、FT-IR 數據均由儀器自帶軟件計算得出，所有試驗均重復測試3 次以上，文中各表數據采用Origin 2018 計算平均值、標準差及顯著性，表示方式采用（平均值加減標準差），顯著性用小寫字母上標表示，不同字母代表差異顯著（P＜0.05）。偏光和SEM 圖片由儀器導出后采用PowerPoint 進行合并、大小調整和添加標注。IR 分峰和XRD 相對結晶度計算采用Peakfit4.12 軟件完成。所有數據繪圖采用Origin 2018 繪制。

2 結果與分析

2.1 酶解對葛根淀粉糊化特性的影響

圖1、表1 分別為葛根淀粉與酶解葛根淀粉的糊化曲線和糊化特征參數。葛根淀粉經酶解后，其各項糊化特征參數均有顯著性差異（P＜0.05）。酶解后葛根淀粉的峰值黏度降低了28.33%，谷值黏度增加了12.53%，崩解值降低了94.69%，最終黏度增加了12.47%，回生值增加了12.37%，糊化溫度上升至85.16 ℃。此結果與GE 等[19]采用普魯蘭酶改性顆粒甘薯淀粉（未糊化，酶解溫度55 ℃）糊化特性的變化一致。

圖1 葛根淀粉（KS）與酶解葛根淀粉（EHKS）的糊化曲線Fig.1 Pasting curves of KS and EHKS

表1 葛根淀粉（KS）與酶解葛根淀粉（EHKS）的糊化特征參數Table 1 Pasting characteristic parameters of KS and EHKS

葛根淀粉糊化特性的變化主要是由普魯蘭酶脫支作用導致的，普魯蘭酶作用于支鏈分子的α-1,6-糖苷鍵，酶解后產支鏈淀粉的分支減少，同時產生大量的短直鏈分子。YAN 等[20]認為淀粉支鏈的分解減少了凝膠組分之間的相互作用從而導致其糊化特性的改變；亦有研究指出峰值黏度與直鏈淀粉含量呈負相關，大量直鏈淀粉與支鏈淀粉分子糾纏在一起限制了淀粉顆粒在糊化過程中的膨脹，從而導致峰值黏度下降和糊化溫度的升高，但在冷卻過程中直鏈淀粉與其他淀粉分子相互作用并形成網絡促進了回生值和最終黏度的提升[21?23]。同時，酶解造成淀粉顆粒結構變得更加疏松，對剪切作用和熱的抵抗力變低[24]，從而使崩解值降低。

2.2 酶解對抗性淀粉含量的影響

葛根淀粉與酶解葛根淀粉的抗性淀粉含量分別為1.29%±0.11%和4.60%±0.04%，抗性淀粉含量增加了3.31%。普魯蘭酶是制備抗性淀粉的常用酶之一，在未糊化條件下對葛根淀粉進行酶解后，其抗性淀粉含量雖然有所提升，但相較于文獻報道（糊化后降溫至60 ℃酶解）的9%～12%抗性淀粉含量明顯偏低[25]。

已有研究表明，淀粉的抗消化性是由多種因素決定的，包括顆粒大小、顆粒表面形狀、淀粉顆粒中孔隙大小、直鏈/支鏈比、直鏈鏈長、支鏈淀粉的線性化和淀粉結晶度等[26]。其中，直鏈淀粉比例與抗性淀粉含量呈正相關[14,27]。抗性淀粉組分可以同時包含結晶區和非晶區[26]，羅志剛等[28]指出，淀粉的結晶度和抗性淀粉含量之間并不呈現一定的規律性，相對于結晶度，結晶的致密性和完美程度對淀粉的抗消化性影響更大[29]。

普魯蘭酶酶解一方面會增加直鏈淀粉含量，另一方面支鏈淀粉脫支后分子鏈間距增大，短直鏈分子可深入支鏈結構與支鏈淀粉的直鏈分支重排為雙螺旋結構，重新生成更為致密的完美結晶[13]，而致密的結晶區會阻礙淀粉的消化，因此抗性淀粉含量增加。此外，在未糊化條件下進行酶解，由于淀粉分子鏈未舒展，普魯蘭酶很難作用于淀粉的完美結晶區，僅對無定形區和不完美結晶區中的支鏈淀粉有切支作用，酶解后完美結晶的相對比例提升，因此酶解后抗性淀粉含量增加。糊化和未糊化條件下酶解造成的抗性淀粉含量差異則是由于糊化后分子鏈更為舒展，普魯蘭酶作用位點相對更多，直鏈淀粉的溶出和生成相對未糊化條件下更多，在回生期間生成大量的RS3 型抗性淀粉[30]。

2.3 酶解對葛根淀粉熱特性的影響

酶解前后葛根淀粉的DSC 圖譜和參數如圖2、表2 所示。從圖中可以看出酶解后葛根淀粉吸熱峰明顯向高溫區偏移。經計算，酶解后葛根淀粉的T0、Tp和Tc顯著增加（P＜0.05），T0從70.15 增加至74.98 ℃，Tp從75.78 ℃增加至79.23 ℃，Tc從82.79 ℃增加至84.03 ℃。△H 和△T 顯著下降（P＜0.05），△H 從5.43 J/g下降至2.58 J/g，△T 從12.63 ℃下降至9.05 ℃。

圖2 葛根淀粉（KS）與酶解葛根淀粉（EHKS）的DSC 曲線Fig.2 DSC curves of KS and EHKS

表2 葛根淀粉（KS）與酶解葛根淀粉（EHKS）的熱性能Table 2 Thermal properties of KS and EHKS

T0和Tc分別代表淀粉顆粒中最弱的微晶和最完美的微晶的熔化溫度[31]。繆銘[32]認為無定形區的水解對結晶熔融過程干擾減少，從而導致T0、Tp和Tc的升高，而影響△T 的因素有結晶形狀與大小、晶體完美程度、淀粉鏈相互纏結形成雙螺旋的類型。普魯蘭酶對葛根淀粉無定形區和不完美結晶酶解后，剩余的完美結晶需要更高的溫度才能熔融，同時脫支處理后產生的大量游離短直鏈分子相互間通過氫鍵結合形成了更多的短程有序結構[33]，直鏈分子間結合力較強，其加熱解聚和熔融時需要更高的溫度。

△H 表示了淀粉顆粒中晶體結構破壞或螺旋解構所需的熱量[34]。未酶解葛根淀粉顆粒中晶體的存在主要為支鏈淀粉的直鏈分支通過氫鍵形成的有序螺旋結構堆積形成晶區，此外還有少量的游離直鏈淀粉夾雜其間，由于支鏈分子分支眾多，其吸熱解構時分支相互間空間位阻較強，因此，需要吸收更多的熱量用于解構[32,35]。酶解后淀粉顆粒體積變大、結構疏松，更易崩解，且支鏈分子的分支的位阻作用減弱，游離短直鏈比例增加，晶體更易解構。

2.4 酶解對葛根淀粉的微觀形貌與粒度影響

葛根淀粉酶解前后的偏光和掃描電鏡觀察結果如圖3 所示。從圖3 可以看出，酶解后淀粉顆粒明顯變大，少量顆粒崩解且存在表層剝落現象（圖3 中a、b、c、d 等處），但顆粒外形仍然相對完整且偏光十字明顯，這一現象與GE 等[19]對甘薯淀粉偏光十字的觀測一致。進一步的通過激光粒度儀分析酶解前后淀粉顆粒的大小，結果如圖4 和表3 所示。從圖4可以看出，酶解后淀粉顆粒粒度明顯變大，且粒度范圍更廣，未酶解時Dx（10）、Dx（50）和Dx（90）分別為1.55、7.57 和13.30 μm，酶解后粒徑增大至3.76、10.80和20.30 μm，其結果印證了RVA 測試中關于酶解后淀粉顆粒膨脹的推測。

表3 葛根淀粉（KS）與酶解葛根淀粉（EHKS）的粒徑參數Table 3 Particle size parameters of KS and EHKS

圖3 葛根淀粉（KS）與酶解葛根淀粉（EHKS）的偏光顯微鏡和SEM 圖Fig.3 Polarized light and SEM images of KS and EHKS

圖4 葛根淀粉（KS）與酶解葛根淀粉（EHKS）的粒度分布Fig.4 Particle size distribution of KS and EHKS

因普魯蘭酶僅作用于α-1,6-糖苷鍵，酶解過程中不影響支鏈淀粉框架結構的完整性，而且酶解在較低的溫度（50 ℃）下進行，酶解切支生成的短直鏈分子仍包含在顆粒內，因此，顆粒外形相對完整，偏光十字仍然存在。但仔細觀察可以發現酶解前后淀粉顆粒的偏光十字外圍有所不同（圖3 中e、f、g 等處），未酶解顆粒偏光十字外圍相對平滑致密，酶解后雖然十字仍然存在，但外圍有明顯的擴散以及光線由外向內的層次遞進。說明酶解首先發生在淀粉顆粒表層，然后向內部遞進，酶解后表層晶體結構破壞相對內部更為嚴重[19]。

2.5 酶解對葛根淀粉的分子與結晶結構的影響

圖5 為酶解前后葛根淀粉的紅外光譜圖。從圖5可以看出，酶解前后葛根淀粉紅外光譜特征吸收峰峰位和峰形未出現明顯變化，說明酶解后未形成新的基團。紅外光譜中3000～3600 cm?1為淀粉分子中OH 的伸縮振動，2900 cm?1附近為C-H 伸縮振動，1640 cm?1附近由淀粉中水分子中的2 個O-H 剪切形成振動[36]，820～1280 cm?1幾個連續強吸收峰是由高度耦合的C-O 和C-C 伸縮振動峰引起的[37]。

圖5 葛根淀粉（KS）與酶解葛根淀粉（EHKS）的紅外光譜Fig.5 FTIR spectra of KS and EHKS

在1047、1022 cm?1處的紅外吸收分別與淀粉顆粒中短程有序結構和無定型結構有關[38]，995 cm?1處的吸收與C-6 處羥基的分子內氫鍵有關，其中，（1047/1022）峰面積比值越大或（1022/995）峰面積比值越小，表明顆粒內短程有序度越高[39]。采用peakfit 軟件對875～1190 cm?1區間紅外光譜進行分峰處理，計算得出1047、1022 和995 cm?1三個峰的面積，計算結果顯示未酶解葛根淀粉A1047/A1022和A1022/A995分別為1.65 和0.71，酶解后分別為3.41 和0.23。酶解后A1047/A1022增加、A1022/A995降低，說明酶解促進了淀粉分子短程有序結構的生成，主要是酶解產生的短直鏈分子通過氫鍵締合重排為有序的螺旋結構。

圖6 為酶解前后葛根淀粉的XRD 曲線及相對結晶度計算結果。從圖6 可以看出，酶解前后葛根淀粉均在15.3°、17.2°和23.1°處出現強衍射峰，為典型的C 型結構。經計算，酶解前后相對結晶度（Xc）分別為37.31%、29.10%，酶解后葛根淀粉相對結晶度降低了8.21%。淀粉顆粒由有序的結晶區和無序的無定形區組成。其中，結晶區主要由支鏈淀粉起到骨架作用，其直鏈分支和長短不同的游離直鏈分子平行排列，通過氫鍵作用形成大致有規則的束狀體即微晶束[40]。普魯蘭酶酶解切支后，微晶區的支鏈分支被切斷，支鏈淀粉的支撐作用減弱，大量短直鏈呈游離狀態分布于淀粉顆粒中，因此導致相對結晶度下降。

圖6 葛根淀粉（KS）與酶解葛根淀粉（EHKS）的XRD 曲線Fig.6 XRD curves of KS and EHKS

3 結論

未糊化條件下，普魯蘭酶對葛根淀粉糊化特性的影響顯著。酶解葛根淀粉的峰值黏度和崩解值降低，但谷值黏度、最終黏度和回生值增加。酶解后葛根淀粉顆粒變大，分子短程有序結構比例增加；XRD相對結晶度下降，但致密的完美結晶比例增加。酶解葛根淀粉的抗性淀粉含量增加了3.31%，但相對于糊化酶解工藝仍有較大差距，后續研究可考慮采用超聲等物理方法輔助酶法提升抗性淀粉含量。本文研究結果可為葛根淀粉的酶法改性及其在固體飲料中的應用提供理論依據。