基于仿生學技術不同發酵方式酸漿水品質評價

李 姚，孔祥聰，琚興波，侯強川，郭 壯，王玉榮,

（1.湖北文理學院，湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北襄陽 441053；2.湖北文理學院，乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室，湖北襄陽 441053；3.湖北璩家餐飲管理有限公司，湖北襄陽 441000）

漿水是以芹菜或白菜等為主料加少量面粉和大量水自然發酵而成的，其不僅是中國地理標識產品酸漿面的特征風味來源，亦是陜南和甘肅等地漿水面的主要配料[1]。近年來研究人員針對酸漿水及其微生物開展了多項研究，主要包括微生物多樣性[2]、降膽固醇菌株的篩選[3]、亞硝酸鹽含量分析[4]以及相關飲料研制[5]等方面，而有關酸漿水發酵方式上的研究相對較少。目前，酸漿水的制作以農家自制為主，一般采用自然發酵的方式，發酵進程較難調控，產品品質不穩定，發展受限。張曉輝等[6]對采集自山西和甘肅的漿水中細菌多樣性進行分析發現，漿水中存在致腐菌和條件致病菌，說明急需改善加工環境或篩選適于酸漿水發酵的菌株來降低潛在風險。王麗萍等[7]探討了面粉添加量、發酵溫度和保藏方法等工藝因素對漿水品質的影響，闡明實現漿水品質的標準化的重要途徑為選擇特定菌種發酵。亦有研究人員發現，純種發酵更適合發酵蔬菜類制品的制作[8]。周書楠等[9]研究發現，乳酸桿菌是琚灣酸漿面漿水中的絕對優勢細菌微生物，并推測乳酸菌發酵對于酸漿水風味的形成起著至關重要的作用。采用16S rRNA 高通量測序技術，彭飛等[10]發現乳酸桿菌屬亦是北方漿水中的優勢菌屬。張振東等[11]采用六種純培養方式對酸漿水中乳酸菌進行分離，發酵乳桿菌的株數占總分離株的48.89%，變性梯度凝膠電泳結果亦顯示發酵乳桿菌和德式乳桿菌為酸漿水中的主要乳酸菌。這些研究為篩選酸漿水發酵菌株提供了指導。

本研究分別采用發酵乳桿菌純種發酵和加引子發酵兩種方式制作漿水，并嘗試使用電子舌、電子鼻和色度儀從滋味、風味和色澤三個維度對漿水的感官品質進行評價。電子舌通過人工脂膜技術可實現同時對漿水中基本味（酸、苦、澀、咸和鮮味）以及回味（澀、苦和鮮味）進行測定，具有檢測速度快、結果準確等優點，目前，在葡萄酒[12]、蜂蜜[13]、蘑菇[14]和奶制品[15]等食品的滋味檢測中應用廣泛。電子鼻通過其金屬氧化電極對食品中典型揮發性風味物質進行測定，從而對漿水揮發性風味進行評價，常用于水果[16]、豬肉[17]、白酒[18]和食用油[19]等食品的檢測。色度儀則直接顯示三刺激值并將其轉化為顏色空間標度，從而對食品的明亮度、紅藍度和黃綠度進行測定，目前廣泛應用于飲用水[20]、番茄醬[21]、牛肉鮮度[22]和鮮切果蔬褐變程度[23]等的檢測。通過比較乳酸菌純種發酵和加引子發酵漿水品質差異，以期為酸漿水的純種發酵以及即食型產品的生產提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸漿水 采集自襄陽市棗陽市琚灣鎮各大面館，主要原料均為芹菜和面粉，經24 h 左右自然發酵而成；純種發酵用菌株 由傳統發酵食品研究所提供，即對15 個酸漿水樣本中乳酸菌進行分離鑒定，然后從每個樣本中挑選一株發酵乳桿菌進行后續實驗，共計15 株；芹菜 市售；面粉 中糧面業（海寧）有限公司；葡萄糖 西隴科學股份有限公司；氯化鈉國藥集團化學試劑有限公司；MRS 培養基 青島海博生物技術有限公司；陽離子溶液、陰離子溶液、內部溶液、預處理溶液、參比溶液 日本Insent 公司。

SA 402B 電子舌（配備5 個味覺傳感器電極和2 個參比電極） 日本Insent 公司；PEN3 電子鼻（配備10 個金屬氧化電極） 德國Airsense 公司；Ultra Scan PRO 色度儀 美國Hunter Lab 公司；CR21N 高速離心機 日本日立公司；PHS-3C 臺式酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；LRH-70 生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 從湖北省襄陽市棗陽市琚灣鎮的不同面館采集15 份自然發酵酸漿面漿水樣品，裝入無菌采樣瓶后密封置于含有冰盒的采樣箱中低溫運回實驗室迅速完成乳酸菌的分離純化。

1.2.2 酸漿水樣品制作 原料前處理：取純凈水煮沸后按0.5%（w/v）比例添加面粉制備面粉漿液，煮沸放涼按1%比例加入漂燙過的芹菜，攪拌均勻制成漿湯后分裝至小發酵罐中，每罐500 mL 備用。

漿水制備：將前期分離至酸漿面漿水的15 株發酵乳桿菌接入MRS 培養基中活化（37 ℃靜置培養24 h）兩代后10000 r/min 離心10 min，沉淀即為菌體，取菌體接入含1%葡萄糖的100 mL 面粉漿液中30 ℃靜置培養24 h 制成菌液。將菌液按5%（v/v）的比例接入分裝好的漿湯中，30 ℃發酵24 h，制備純種發酵漿水，編號分別為T1～T15。以采集的15 份自然發酵酸漿為引子，按照5%（v/v）的比例加入到制備好的漿湯，30 ℃發酵24 h，制備引子發酵酸漿，編號依次為Z1～Z15。制備T1 的發酵乳桿菌分離至制備Z1 的引子，制備T2 的菌株來源于發酵Z2 的引子，依次類推。

1.2.3 不同發酵方式漿水滋味特征分析 準確量取50 mL 發酵后的漿水樣品和100 mL 純凈水混合均勻，靜置30 min 后進行抽濾，取濾液參考王丹丹等[24]的測試方法使用電子舌進行參數測試。為減少系統誤差，每次測定時均設置Z1 號樣品作為對照樣本，數據分析時待測樣品與對照樣本的差值即為待測樣品各滋味品質的相對強度值。

1.2.4 不同發酵方式漿水揮發性風味測定 準確吸取15 mL 發酵好的漿水于電子鼻樣品瓶中，水浴鍋中50 ℃保溫30 min，室溫平衡10 min 后插入電子鼻探頭進行進樣，參考張松等[25]的測試方法進行參數測試。每個樣品測試90 s，由于傳感器的響應值在70 s 后達到穩定，選取85、86 和87 s 時的響應值作為本研究的測試結果。

1.2.5 不同發酵方式漿水色澤分析 本研究參考郭壯等[26]的研究對不同發酵方式漿水的色澤進行評價。將漿水裝入50 mm×50 mm 的專用比色皿中，采用色度儀對其色澤品質進行評價，測試模式選擇透視測試，讀數以CIE1976 色度空間值L*（暗→亮：0→100），a*（綠-→紅+），b*（藍-→黃+）表示。

1.3 數據處理

采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic，UPGMA）和多元方差分析法（multivariate analysis of vari-ance，MANOVA）對不同發酵方式漿水的整體品質進行分析，采用t檢驗、Mann-Whiney 檢驗和冗余分析（Redundancy analysis，RDA）對不同發酵方式漿水品質差異的關鍵性指標進行甄別。采用Cannoco 4.5 軟件、MATLAB 2016b 軟件和Origin 2017 完成數據分析和可視化。

2 結果與分析

2.1 不同發酵方式漿水品質分析

琚灣酸漿面風味特征為酸、香、辣，是湖北省非物質文化遺產和中國地理標識產品[27]，其酸味及主體香味主要來源于酸漿水，因此，酸漿水口感、風味等發酵特征對成品酸漿面品質有著重要的影響。本研究首先使用電子舌對15 份發酵乳桿菌單菌發酵酸漿水及15 份老鹵水引子發酵酸漿水的滋味特征進行了測定，兩類樣本的8 個滋味指標測定結果見圖1。

圖1 不同發酵方式酸漿水各滋味指標相對強度箱型圖Fig.1 Box diagram of relative intensity of each taste index of Suanjiangshui with different fermentation methods

由圖1 可知，不同發酵方式制作的漿水酸、苦、澀、咸和鮮味之間均具有較大的差異，其中，澀味的差異性最大，酸味次之；后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）之間的差異性較小。發酵乳桿菌純種發酵的漿水鮮味相對強度明顯高于用引子發酵，而酸味和澀味正好相反。漿水經過多輪次發酵，其中的微生物相較凍存過的純種菌株能更快適應漿湯環境，發酵產酸更快；此外，不同農戶自制老鹵水發酵輪次多且不盡相同也使得其中乳酸等有機酸不斷積累，這也可能是導致用其發酵漿水酸度較單菌發酵漿水強度大且組內差異亦較后者明顯的原因。值得注意的是不同發酵乳桿菌接菌發酵漿水澀味差異較大，表明這些菌株雖然都分離至自然發酵漿水但并不都適宜單獨發酵酸漿水。

本研究進一步使用電子鼻對不同發酵方式漿水的揮發性風味進行了測定，結果見表1。

由表1 可知，發酵乳桿菌純種發酵制作的漿水在三個對芳香類風味靈敏的傳感器（W1C、W3C 和W5C）上的響應強度顯著高于加引子發酵漿水（P＜0.05），而在對有機硫化物、萜類物質（W1W）以及烷烴靈敏的傳感器（W3S）上的響應值呈現相反的趨勢（P＜0.05）。由此可見，總體上發酵乳桿菌純種發酵制備的漿水揮發性風味要明顯優于用引子發酵的漿水，這與前期研究發現的發酵乳桿菌發酵的酸漿水芳香類風味物質的含量高于植物乳桿菌與德氏乳桿菌發酵漿水的結論相似[28]。此外，望詩琪等[29]采用氣相色譜-質譜聯用技術從琚灣酸漿面漿水中檢測出的揮發性風味物質有159 種，并推測較高含量3-丁炔-1-丁醇的檢出可能來源于漿水的盛裝容器。因此，引子發酵漿水不良風味相對強度較單一菌株發酵漿水高可能是因為引子中微生物種類復雜，開放發酵易滋生污染菌。此外，部分引子原是盛于塑料容器中發酵，長時間循環使用亦可能摻入雜味。

表1 不同發酵方式酸漿水風味特性及差異Table 1 Flavor characteristics and differences of Suanjiangshui by different fermentation methods

為更準確顯示接菌及加引子發酵酸漿水的色澤特征和差異，本研究使用色度儀對的色澤特征進行了測定，分析結果見表2。

表2 不同發酵方式酸漿水各色度指標的差異性分析Table 2 Analysis on the difference of chromaticity indexes of Suanjiangshui with different fermentation methods

好的漿水呈淡乳白色，略帶綠色，色澤均勻不分層，表面無白膜。經檢測，本研究采用引子發酵和接菌發酵制作的漿水色澤均較為明亮，整體偏綠偏藍，符合酸漿水發酵特征。經對比，發酵乳桿菌純種發酵制備的酸漿水其明亮度顯著高于加引子發酵（P＜0.05），a*值則呈現出相反的趨勢（P＜0.05）。由此可見，較之加引子發酵，乳酸菌純種發酵的酸漿水顏色偏亮偏綠，通過計算發現二者色差值（△E*）為3.05，因而不同發酵方式對酸漿水色澤有明顯的影響。不同發酵方式酸漿水色差明顯可能與其酸度及發酵程度有關，電子舌檢測結果顯示，加引子發酵酸漿水酸度高于加發酵乳桿菌發酵，說明引子發酵酸漿水發酵程度更高，pH 降低及微生物活動會導致芹菜葉綠素損失率增加[30]。

2.2 不同發酵方式制備酸漿水整體品質差異性分析

本研究使用PCA、MANOVA 和UPGMA，以電子舌和電子鼻測試指標為對象，進一步探究了不同發酵方式酸漿水整體感官品質差異。由PCA 發現，總方差87.92%的貢獻率來自于前6 個主成分（principal component，PC），其方差貢獻率依次為32.89%、20.14%、13.65%、9.82%、6.40%和5.01%。由此可知，6 個主成分可以代表原始數據18 個變量的絕大部分信息。基于PC1 和PC2 不同發酵方式酸漿水品質的因子載荷圖如圖2 所示。

由圖2 可知，影響接菌和引子發酵漿水整體品質的關鍵感官指標為澀味、酸味、W5S、W2W、W1W和W1C。澀味在PC1 中的系數為0.49，PC2 中載荷最高的正影響指標為酸味，其載荷量為0.40，而在PC2 中載荷最高的負影響指標為W1C（對芳香類物質靈敏），其載荷量為0.26。即PC1 的主要差異集中在澀味，而PC2 的主要差異則集中在酸味和W1C。基于PC1 和PC2 不同發酵方式酸漿水品質的因子得分圖見圖3。

圖2 不同發酵方式酸漿水品質的因子載荷圖Fig.2 Factor load diagram of Suanjiangshui quality with different fermentation methods

圖3 不同發酵方式酸漿水品質的因子得分圖Fig.3 Factor score diagram of Suanjiangshui quality with different fermentation methods

由圖3 可知，基于感官特征接菌發酵與加引子發酵漿水樣品具有明顯的分離趨勢，引子發酵酸漿水樣本主要集中在X 軸正軸方向，發酵乳桿菌接菌發酵樣品大多分布在第二、三象限，部分樣品在橫縱坐標上均較為分散。此外，引子發酵酸漿水Z12 與接菌發酵樣本較為接近，而接菌發酵酸漿水T1、T7、T9 和T11 與引子發酵樣品聚在一起，究其原因，引子來源于不同家庭手工制作酸漿水其微生物組成及品質不完全相同，因此15 個樣本并未完全重疊，而15 株發酵乳桿菌來源于對應的15 個引子，引子和菌株發酵酸漿水部分樣本品質會較為相近。引子發酵與接菌發酵對應編號樣本間亦存在差異。結合因子載荷圖，與接菌發酵漿水相比，引子發酵酸漿酸澀味較濃但芳香味卻不及前者。整體上，乳酸菌純種發酵的酸漿水在滋味和風味品質上要優于引子發酵。將數據進行歸一化處理后，采用UPGMA 對PCA 結果進行進一步驗證。其結果如圖4 所示。

由圖4 可知，當平均距離為3.0 時，酸漿水樣品可分為3 個聚類。聚類Ⅰ共計18 個酸漿水樣品，其中，引子發酵樣品14 個，發酵乳桿菌發酵樣品4 個；聚類Ⅱ共計10 個酸漿水樣品，其中，乳酸菌發酵的樣品有9 個，僅1 個樣品為引子發酵；而聚類Ⅲ中2 個樣品，均為發酵乳桿菌發酵漿水。由此可見，UPGMA 聚類分析的結果與PCA 基本一致，即乳酸菌純種發酵與引子發酵的酸漿水樣品在滋味和風味品質上存在明顯差異。

圖4 基于UPGMA 的不同發酵方式酸漿水滋味和風味品質評價Fig.4 Evaluation of the taste and flavor quality of Suanjiangshui by different fermentation methods based on UPGMA

2.3 不同發酵方式酸漿水品質與各感官指標間關系

本研究通過PCA 和UPGMA 聚類分析等多元統計學分析發現了不同發酵方式會對酸漿水的滋味和風味品質造成明顯的影響。通過t檢驗亦發現，不同發酵方式的部分滋味和風味指標存在差異顯著（P＜0.05）。為進一步探究導致酸漿水品質整體結構的不同的感官指標，本研究采用RDA 這一有監督的多元統計學方法對導致上述差異的指標進行解析，結果如圖5 所示。

圖5 冗余分析雙序圖Fig.5 Biplot of redundancy analysis

由圖5 可知，W3S、W2W、W5S、W1W、W1C、W5C、W3C 和鮮味與RDA 排序約束軸上的酸漿水樣品具有良好的賦值相關，即上述8 個指標代表了不同發酵方式制作酸漿水品質總體結構差異顯著相關的關鍵指標。W3S、W2W、W5S 和W1W 位于引子發酵一側，說明這4 個指標在加引子發酵的酸漿水中強度高于乳酸菌純種發酵；而鮮味、W1C、W3C 和W5C 則呈現出相反的趨勢。結合2.1 中結果可知，W3S、W1C、鮮味、W3C 和W5C 在兩者中存在顯著性差異（P＜0.05），而W2W 和W5S 差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，發酵乳桿菌純種發酵制作的酸漿水中芳香類物質含量較高、烷烴類物質含量較低是導致其與加引子發酵方式制作的酸漿水品質差異的主要原因。

3 結論

使用電子舌、電子鼻和色度儀并結合多元統計學方法解析不同發酵方式的酸漿水品質，結果顯示15 株發酵乳桿菌純種發酵的酸漿水鮮味、芳香類風味和明亮度等指標均顯著高于加引子發酵酸漿水（P＜0.05），而酸味、澀味、有機硫化物等指標強度呈現相反趨勢（P＜0.05）。整體上以發酵乳桿菌純種發酵制作的酸漿水品質更優。同時考慮到乳酸菌接菌發酵漿水品質可控性更強、成品安全性較高的特點，后期可進一步對菌株生長特性進行研究，嘗試篩選互補菌株進行混菌發酵。