微波超聲協(xié)同提取白刺果原花青素工藝及抗氧化性研究

只德賢，張 妮，李建穎

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，國家級(jí)食品與藥品實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津 300134）

白刺（Nitraria tangutorumBobr.）為蒺藜科白刺屬植物，廣泛分布于我國新疆、青海、內(nèi)蒙古、甘肅等地，是旱生植物，對(duì)生長環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，已成為荒漠區(qū)、風(fēng)沙地區(qū)優(yōu)勢(shì)植物，可以防風(fēng)固沙，維護(hù)荒漠生態(tài)穩(wěn)定[1]。白刺植物具有較高的應(yīng)用價(jià)值，營養(yǎng)豐富，富含多糖、氨基酸、揮發(fā)油、黃酮類、酚類、生物堿等多種有效成分[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白刺具有降血糖[3?4]、降血壓[5]、抑制腫瘤生長、抗氧化[6]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗疲勞[7]及神經(jīng)保護(hù)[8]等作用。原花青素（proanthocyanidin，PC），是有著特殊結(jié)構(gòu)的生物類黃酮混合物，分為低聚和高聚原花青素[9]，主要存在于植物的果皮、果實(shí)和種子中。原花青素有保護(hù)血管、降血脂[10]、改善胃腸功能[11]和認(rèn)知障礙[12]等作用。原花青素還被稱為“天然抗氧化劑”，它可以有效地清除人體內(nèi)的自由基[13?14]，其清除DPPH 自由基、羥自由基的能力均高于VC和VE[15?16]。

目前，從植物中提取原花青素的方法有萃取法[17]、超臨界提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和酶輔助提取法等[18]。超聲波可以加速細(xì)胞壁的破裂，使細(xì)胞內(nèi)的成分充分進(jìn)入到溶劑中，超聲輔助提取可以有效地縮短提取時(shí)間，提高提取效率[19]；微波可以使物體局部受熱，加速目標(biāo)成分的溶出，微波輔助提取能夠節(jié)約溶劑，縮短提取時(shí)間，避免因提取時(shí)間過長造成目標(biāo)成分的分解[20]。魏文慧等[21]采用超聲-微波協(xié)同法對(duì)酒花殘?jiān)械脑ㄇ嗨剡M(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)原花青素的提取率顯著高于超聲波提取法或微波提取法，而微波超聲協(xié)同提取白刺果原花青素的方法尚未見報(bào)道。

目前，白刺資源的利用率較低，同時(shí)也是原花青素的主要來源，因此，本文采用響應(yīng)面法對(duì)微波超聲協(xié)同提取白刺果原花青素的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用大孔吸附樹脂法對(duì)提取物進(jìn)行純化。再對(duì)純化后的白刺果原花青素進(jìn)行體外抗氧化活性測定，以期為更好地開發(fā)利用白刺資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白刺果 甘肅武威（2020 年9 月采收）；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 美國Sigma 公司；2,4,6-三吡啶基三嗪[2,4,6-Tris（2-pyridyl）-striazine，TPTZ] 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；兒茶素（純度98%）、香草醛（純度98%） 標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；AB-8 型大孔樹脂南開大學(xué)化工廠；羥自由基測試試劑盒 南京建成生物工程研究所；甲醇、乙醇、濃鹽酸、濃硫酸 均為分析純，天津鑫橋化工貿(mào)易有限公司。

XO-SM100 超聲波微波協(xié)同反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司；UV-2802S 紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯公司；RV10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 廣州IKA儀器設(shè)備有限公司；Quintix125D 分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Integral 10 超純水系統(tǒng)Merck 公司；DFT-500 中藥粉碎機(jī) 浙江榮浩工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白刺果原花青素提取工藝 白刺果樣品置45 ℃干燥箱烘干，粉碎后過60 目篩，備用。參照文獻(xiàn)[22]方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取白刺果粉末2.00 g，提取后抽濾、濃縮、凍干，得到白刺果原花青素提取物。在微波功率200 W（室溫），超聲提取（功率300 W）30 min 的條件下，考察不同液料比、乙醇濃度、微波時(shí)間、超聲溫度對(duì)原花青素得率的影響。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 液料比對(duì)得率的影響 固定乙醇濃度為70%，超聲溫度50 ℃，微波時(shí)間2 min，分別考察液料比為5、10、15、20、25 mL/g 對(duì)白刺果原花青素得率的影響。

1.2.2.2 乙醇濃度對(duì)得率的影響 固定液料比為15 mL/g，超聲溫度50 ℃，微波時(shí)間2 min，分別考察乙醇濃度為40%、50%、60%、70%和80%對(duì)白刺果原花青素得率的影響。

1.2.2.3 微波時(shí)間對(duì)得率的影響 固定乙醇濃度為70%，液料比為15 mL/g，超聲溫度50 ℃，分別考察微波時(shí)間為1、2、3、4 min 對(duì)白刺果原花青素得率的影響。

1.2.2.4 超聲溫度對(duì)得率的影響 固定乙醇濃度為70%，液料比為15 mL/g，微波時(shí)間2 min，分別考察超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃對(duì)白刺果原花青素得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert.V 10.0.7 軟件以原花青素得率為響應(yīng)值，選取乙醇濃度、液料比、微波時(shí)間、超聲溫度為自變量，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)白刺果原花青素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面的因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.4 原花青素得率的計(jì)算

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，置于10 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容，即得濃度為1 mg/mL 的兒茶素母液。

分別配成濃度為 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 于具塞試管中，依次加入濃度為0.04 g/mL 的香草醛-甲醇溶液3 mL 和1.5 mL 濃鹽酸，45 ℃避光反應(yīng)30 min，在500 nm 處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[22]。回歸方程為：y=0.4669x+0.1366，R2=0.9991，線性范圍0.2～1.0 mg/mL。

1.2.4.2 原花青素得率的計(jì)算 計(jì)算公式（1）如下。

式中：W 為原花青素得率，mg/g；c 為根據(jù)吸光度值計(jì)算出的原花青素濃度，mg/mL；D 為溶液稀釋倍數(shù)；V 為供試品溶液體積，mL；m 為白刺果粉末取樣量，g。

1.2.5 白刺果原花青素提取物的純化 參照文獻(xiàn)[23?24]方法，采用AB-8 型大孔樹脂對(duì)上述白刺果原花青素提取物進(jìn)行純化。取5 g 預(yù)處理好的AB-8 型大孔樹脂裝入色譜柱，上樣質(zhì)量濃度5.0 mg/mL，上樣流速1 BV/h，洗脫液乙醇濃度40%，收集洗脫液，按公式（2）計(jì)算原花青素純度，濃縮，凍干備用。

式中：c 為洗脫液中原花青素濃度，mg/mL；V 為洗脫液體積，mL；m 為原花青素純化物凍干后質(zhì)量，mg。

1.2.6 白刺果原花青素體外抗氧化分析

1.2.6.1 DPPH 自由基清除率的測定 參照謝瑞等[25]的方法，取上述經(jīng)純化后的原花青素粉末配成濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL 的原花青素提取液。分別取不同濃度的原花青素提取液和VC溶液2.0 mL，加入2.0 mL 濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，置于暗處靜置30 min，測定517 nm處的吸光度A，根據(jù)公式（3）計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：A 為樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液本底吸光度；A0為空白對(duì)照溶液吸光度。

1.2.6.2 ABTS 自由基清除率的測定 參照王偉等[26]的方法，取2 mmol/L ABTS 溶液50 mL 和70 mmol/L過硫酸鉀溶液200 mL 混勻后，4 ℃低溫放置12 h，使用時(shí)用無水乙醇稀釋，使其在734 nm 波長處吸光度A0為0.70±0.02。分別取0.1 mL 濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL 純化后的白刺果原花青素提取液和VC溶液，加入1.9 mL 稀釋后的ABTS自由基溶液，靜置15 min，測定734 nm 處的吸光度A，根據(jù)公式（4）計(jì)算ABTS 自由基清除率。

式中：A0為樣品本底的吸光度；A 為樣品溶液在734 nm 處測定的吸光度；A空為用無水乙醇代替樣品在734 nm 處測定的吸光度。

1.2.6.3 還原能力（Ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測定 FRAP 工作液：配制0.3 mol/L pH 為3.6 的醋酸鈉緩沖液、10 mmol/L 的TPTZ 溶液和20 mmol/L 的三氯化鐵溶液，按10:1:1 的體積比混合即得FRAP 工作液。

參考李穎晨等[27]的方法，分別取0.1 mL 濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL 純化后的白刺果原花青素提取液和VC溶液，加入3 mL FRAP工作液，充分混合均勻后，37 ℃水浴避光反應(yīng)10 min，在593 nm 測定吸光度值。按照上述方法，測定FeSO4系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度范圍0.1～1.0 mmol/L）的吸光度值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)的FeSO4濃度，即為FRAP 值，此值越大，表明其還原能力越強(qiáng)。

1.2.6.4 羥自由基清除率的測定 分別取0.1 mL 濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL 純化后的白刺果原花青素提取液和VC溶液，參照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行測定。按公式（5）計(jì)算羥自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)操作均平行測定3 次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel2010 進(jìn)行單因素?cái)?shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析及作圖，Design-Expert.V10.0.7 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析，SPSS 20.0 軟件得到半數(shù)抑制率IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)白刺果原花青素得率的影響 如圖1所示，在液料比為5～15 mL/g 時(shí)，隨著溶劑的增加，白刺果原花青素得率呈上升狀態(tài)，液料比為15 mL/g時(shí)，原花青素得率最高，達(dá)到16.93 mg/g，當(dāng)液料比超過15 mL/g 時(shí)，白刺果原花青素得率呈下降趨勢(shì)。可能是由于溶劑太少不利于原花青素的溶出，當(dāng)溶劑達(dá)到一定程度時(shí)白刺果中原花青素已充分溶出，繼續(xù)增加溶劑用量會(huì)使白刺果粉末受到的作用力減小[28]，導(dǎo)致原花青素得率下降。故選取液料比10、15、20 mL/g進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 液料比對(duì)白刺果原花青素得率的影響Fig.1 The effect of material liquid ratio on extraction rate of Nitraria proanthocyanidins

2.1.2 乙醇濃度對(duì)白刺果原花青素得率的影響 如圖2 所示，當(dāng)乙醇濃度在40%～70%之間時(shí)，白刺果原花青素得率隨乙醇濃度的升高而增大，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，白刺果原花青素得率達(dá)到最大，為17.03 mg/g，之后隨著乙醇濃度的升高，白刺果原花青素的得率反而降低，可能是由于隨著乙醇濃度的增加，溶液的極性發(fā)生了變化，一些醇溶性或脂溶性雜質(zhì)成分的溶出增加，與原花青素競爭乙醇，導(dǎo)致得率下降[29]。因此，選取乙醇濃度60%、70%、80%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對(duì)白刺果原花青素得率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction rate of Nitraria proanthocyanidins

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)白刺果原花青素得率的影響 如圖3 所示，隨著微波時(shí)間的延長，白刺果原花青素得率先增大后減小，是因?yàn)槿芤褐懈鞒煞治盏哪芰渴狗肿拥臒o規(guī)則熱運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)導(dǎo)致擴(kuò)散速率增加，當(dāng)微波時(shí)間為2 min 時(shí)，白刺果原花青素得率為17.13 mg/g，達(dá)到最大，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)殚L時(shí)間的微波作用使局部溫度過高，破環(huán)了原花青素的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率下降[30?31]。因此，選取微波時(shí)間1、2、3 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 微波時(shí)間對(duì)白刺果原花青素得率的影響Fig.3 The effect of microwave time on extraction rate of Nitraria proanthocyanidins

2.1.4 超聲溫度對(duì)白刺果原花青素得率的影響 由圖4 可知，超聲溫度在30～50 ℃內(nèi)，隨著溫度的升高，原花青素得率增加，超聲溫度為50 ℃時(shí)得率最高，達(dá)到16.47 mg/g。之后隨著超聲溫度的升高，白刺果原花青素得率反而下降，說明隨著溫度的升高，有效成分的擴(kuò)散速率加快，但溫度過高會(huì)使原花青素分解，導(dǎo)致得率下降[29]。因此，選取40、50、60 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 超聲溫度對(duì)白刺果原花青素得率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on extraction rate of Nitraria proanthocyanidins

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 模型建立及方差分析 利用Design-Expert.V10.0.7 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

經(jīng)回歸擬合后，得出模型的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=17.47?0.595A?0.4342B?0.4592C+0.295D?0.0825AB+0.715AC+0.3125AD?0.615BC+0.51BD?0.4875CD?0.7679A2?0.8117B2?1.4917C2?0.9729D2。

對(duì)上述回歸模型的方差及顯著性分析結(jié)果見表3。

由表3 可知，模型的P＜0.0001，達(dá)到極顯著，失擬項(xiàng)的P值為0.8753，不顯著（P＞0.05），表明該模型的擬合度良好，R2=0.9312，表明有93.12%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以運(yùn)用該模型進(jìn)行分析，試驗(yàn)誤差小，模型的可靠性較高。因此，可用該模型分析和預(yù)測白刺果原花青素的得率。

由表3 還可看出，模型中一次項(xiàng)A、B 和C，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2和交互項(xiàng)AC 對(duì)白刺果原花青素得率影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)D、交互項(xiàng)BC、BD 和CD 對(duì)白刺果原花青素得率影響顯著（P＜0.05），根據(jù)F值大小可以判斷出各因素對(duì)白刺果原花青素得率的影響大小依次為A（乙醇濃度）＞C（微波時(shí)間）＞B（液料比）＞D（超聲溫度）。

表3 模型回歸方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression equation

2.2.2 因素間交互作用分析 通過Design-Expert.v10.0.7 軟件繪制的響應(yīng)面立體曲面圖進(jìn)一步分析和評(píng)價(jià)兩個(gè)因素之間的交互作用，其曲面越陡峭，說明兩個(gè)因素的交互作用越顯著，各因素交互作用響應(yīng)面圖見圖5。由圖5 可以看出，AC 的交互作用對(duì)白刺果原花青素得率的影響極顯著，BC、BD 和CD 對(duì)白刺果原花青素得率影響顯著，這與表3 的方差分析結(jié)果相一致。

圖5 各因素交互作用對(duì)白刺果原花青素得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the effects of each factor on the extraction rate of Nitraria proanthocyanidins

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 由回歸方程得到的白刺果原花青素最佳提取工藝條件為：乙醇濃度65.18%，液料比14.47 mL/g，微波時(shí)間1.73 min，超聲溫度51.12 ℃。在此工藝條件下白刺果原花青素得率的預(yù)測值為17.714 mg/g。考慮到實(shí)際操作的可行性，將上述最佳工藝條件修正為：乙醇濃度65%，液料比14.5 mL/g，微波時(shí)間2 min，超聲溫度50 ℃，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得到白刺果原花青素得率平均值為（17.289±0.402）mg/g，與理論預(yù)測值相差2.4%，說明由該模型優(yōu)化的最佳提取工藝條件穩(wěn)定可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 白刺果原花青素純化結(jié)果

利用AB-8 型大孔樹脂純化白刺果原花青素提取物，在上樣質(zhì)量濃度5.0 mg/mL，上樣流速1 BV/h，洗脫液乙醇濃度40%條件下，收集洗脫液，計(jì)算得到的白刺果原花青素純度為81.4%，低于蠶豆皮原花青素純化后94.33%的純度[32]，與黑果腺肋花楸原花青素純度78.4%相當(dāng)[33]。

2.4 白刺果原花青素體外抗氧化活性結(jié)果

2.4.1 DPPH 自由基清除能力的測定 由圖6 可知，純化后的白刺果原花青素和VC溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性。白刺果原花青素濃度為0.30 mg/mL 時(shí)，其對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到78.02%，IC50為0.159 mg/mL，略低于VC（IC50為0.188 mg/mL），與文獻(xiàn)報(bào)道花生紅衣中原花青素清除DPPH 自由基結(jié)果相一致[34]。

圖6 不同濃度的白刺果原花青素對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.6 Scavenging ability of different concentration of Nitraria proanthocyanidins on DPPH·

2.4.2 ABTS 自由基清除能力的測定 由圖7 可知，純化后的白刺果原花青素和VC溶液對(duì)ABTS 自由基的清除率隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。白刺果原花青素濃度為0.30 mg/mL 時(shí)，其對(duì)ABTS 自由基的清除率達(dá)到61.72%，IC50為0.261 mg/mL，略低于VC（IC50為0.308 mg/mL）。在相同濃度條件下，白刺果原花青素對(duì)ABTS 自由基的清除率整體低于對(duì)DPPH 自由基的清除率，表明其對(duì)DPPH 自由基具有更好的清除能力。

圖7 不同濃度的白刺果原花青素對(duì)ABTS 自由基的清除作用Fig.7 Scavenging ability of different concentration of Nitraria proanthocyanidins on ABTS+·

2.4.3 還原能力的測定 FRAP 法測定白刺果原花青素還原能力如圖8 所示。

鐵離子還原抗氧化分析法用于一些抗氧化劑和植物提取物的總抗氧化活性的判定,結(jié)果可反映抗氧化劑還原能力的大小[27]。由圖8 可知，F(xiàn)RAP 法測定抗氧化活性有劑量依賴關(guān)系，在測定的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，純化后的白刺果原花青素和VC的FRAP 值增大，且呈一定的正相關(guān)，但VC的總抗氧化能力在高濃度時(shí)明顯低于純化后的白刺果原花青素，這與浦娜娜[35]的研究結(jié)果相一致。

圖8 不同濃度白刺果原花青素的鐵離子還原能力Fig.8 Reducing power of different concentration of Nitraria proanthocyanidins

2.4.4 羥自由基清除能力的測定 羥自由基是非常活潑的自由基，可以很容易跨越細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，毒性相對(duì)較大[36]。由圖9 可知，純化后的白刺果原花青素和VC溶液對(duì)羥自由基的清除率隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性。白刺果原花青素與VC（IC50為0.301 mg/mL）相比其清除羥自由基的活性相對(duì)較弱，IC50為0.712 mg/mL。當(dāng)濃度為0.30 mg/mL 時(shí)，其對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到31.80%。

圖9 不同濃度的白刺果原花青素對(duì)羥自由基的清除作用Fig.9 Scavenging ability of different concentration of Nitraria proanthocyanidins on hydroxyl free radicals

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用微波輔助超聲法提取白刺果原花青素，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度65%，液料比14.5 mL/g，微波時(shí)間2 min，超聲溫度50 ℃。在該條件下，白刺果原花青素得率為（17.289±0.402）mg/g，采用大孔樹脂純化后的純度為81.4%。抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明純化后的白刺果原花青素對(duì)羥自由基具有一定的清除能力，IC50為0.712 mg/mL；對(duì)ABTS 自由基和DPPH 自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，IC50分別為0.261 和0.159 mg/mL。結(jié)果表明，微波超聲聯(lián)合提取白刺果原花青素具有明顯的協(xié)同作用，能夠明顯地縮短提取時(shí)間，提高提取效率。白刺資源豐富，具有多種有效成分，基于以上研究，白刺果原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基能力和抗氧化活性，為白刺資源的進(jìn)一步全方位開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。