超聲波輔助熱堿法提取藜麥蛋白的工藝優化

袁孝瑞，陳賀宇，劉 玉，武青杭，楊 柳，趙巖巖，周海旭，朱明明，蔡自然，趙圣明

（河南科技學院食品學院，河南新鄉 453003）

藜麥（學名：Chenopodium quinoaWilld）是藜科藜屬植物，具有多種藥用價值，被列為十大營養食品之一[1]。藜麥作為類全谷物，氨基酸種類豐富，除了9 種人類必需氨基酸外，還含有許多非必需氨基酸，特別是富集多數作物沒有的賴氨酸，且蛋白質含量最高可以達到16%～22%，營養價值與奶粉及肉類相當，還含有豐富的不飽和脂肪酸、少量的糖類物質、多種礦物質和維生素等，具有促進人體健康的作用，被國際營養學家稱為丟失的“遠古黃金”，被素食主義愛好者奉為“素食之王”[2?4]。

目前已有關于藜麥蛋白提取工藝的相關報道。王棐[5]采用堿提酸沉法提取藜麥蛋白，通過正交優化得到蛋白提取率可達67.13%。但正交試驗只能分析離散型數據，精確度不高且預測性較差。馬洪鑫等[6]采用堿提酸沉法提取藜麥蛋白，再利用響應面法對蛋白質提取工藝進行優化，總蛋白提取率可達76.84%。田格等[7]采用復合酶解法提取藜麥蛋白，總蛋白提取率達到了76.82%。CBRINEGAR 等[8?9]分別在pH9和pH11 的堿性條件下浸提藜麥蛋白，得到相應的Q9 和Q11 兩種蛋白質。但由于pH 高導致Q11 在提取過程中發生了變性。雖然堿法工藝成本低，但是存在pH 高、制備蛋白易變性且提取率低等缺點；干法分級和濕法碾磨得到的谷物蛋白營養成分流失較少，可充分挖掘谷物的營養價值和經濟價值，但獲取組分中蛋白純度較低；酶法制備藜麥蛋白反應條件較溫和，所得蛋白營養價值高，但其工藝成本較堿法高[10]。超聲波提取技術通過空穴效應，有利于蛋白質的快速分離和制備，可以提高蛋白的提取率，縮短提取時間，使用范圍廣，操作簡單且成本低[11?12]。超聲波輔助提取法目前已廣泛用于小麥蛋白、玉米蛋白和花生蛋白等的提取工藝中[13?15]。但關于超聲波輔助堿法提取藜麥蛋白的研究卻鮮有報道。

本文以市售新鮮藜麥為原料，以藜麥蛋白的提取率為考察指標，利用超聲波輔助熱堿法，研究料液比、超聲功率、溫度和超聲時間等因素對藜麥蛋白提取率的影響，通過響應面優化獲得各因素的最優組合，并且測定了蛋白的乳化性和穩定性，旨在為藜麥蛋白的提取及進一步開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥（九月中下旬采收） 山東老鄉生態農業有限公司；大豆油 益海（周口）糧油工業有限公司；氫氧化鈉 天津市東麗區天大化學試劑廠；考馬斯亮藍G-250、磷酸 天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇 天津新技術產業園區科茂化學試劑有限公司；鹽酸 鄭州派尼化學試劑廠；十二烷基硫酸鈉（SDS） 西隴科學股份有限公司，以上試劑均為分析純。

FW100 高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；722N 可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Sorvall LYNX 4000 高速離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SB-4200 DTD 型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；雷磁PHS-2F pH 計 上海雷磁儀器有限公司；梅特勒-托利多ME104 電子天平 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；QL-866 旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；IKA T18 高速分散機 德國IKA 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將藜麥清洗干凈，經80 ℃恒溫干燥4 h 去除水分，使用粉碎機粉碎，過60 目篩，得到藜麥粉，置于干燥器中備用。

1.2.2 藜麥蛋白的提取 參考薛穎等[16]和桂向東等[17]的方法，取5 g 藜麥粉，以1%的NaOH 溶液作為溶劑，將其充分溶解后，采用超聲波輔助法進行蛋白的提取，在4 ℃、8000 r/min 條件下離心10 min，收集上清液，使用HCl 調節pH 至4.5，靜置30 min 后，在5000 r/min 條件下離心15 min，收集沉淀，使用蒸餾水洗滌，最后將所得沉淀pH 調至7，冷凍干燥后，即得所提藜麥蛋白。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 溫度對藜麥蛋白提取率的影響 稱取5 g 藜麥粉，在超聲功率250 W，料液比1∶20 g/mL，超聲時間1.5 h 的條件下，分別考察不同溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）對藜麥蛋白提取率的影響。

1.2.3.2 超聲時間對藜麥蛋白提取率的影響 稱取5 g藜麥粉，在超聲功率250 W，料液比為1∶20 g/mL，超聲溫度35 ℃，的條件下，分別考察不同時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）藜麥蛋白提取率的影響。

1.2.3.3 料液比對藜麥蛋白提取率的影響 稱取5 g藜麥粉，在超聲功率250 W，超聲溫度35 ℃，超聲時間1.5 h 的條件下，分別考察不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL）對藜麥蛋白提取率的影響。

1.2.3.4 超聲功率對藜麥蛋白提取率的影響 稱取5 g 藜麥粉，在提取溫度35 ℃，料液比1∶20 g/mL，超聲時間1.5 h 條件下，考察不同超聲功率（100、200、250、300、350、400 W）對藜麥蛋白提取率的影響。

1.2.4 響應面試驗 由于超聲時間對藜麥蛋白提取率的影響較顯著，所以在單因素實驗結果的基礎上，選取溫度（A）、料液比（B）、超聲功率（C）三個因素為考察對象，探究三個因素對藜麥蛋白提取率的綜合影響，依據中心組合設計（CCD）進行試驗設計，采用Design-Expert 8.0.6 軟件處理數據，對藜麥蛋白的提取工藝做進一步的優化[18?20]。

1.2.5 藜麥蛋白提取率的計算

1.2.5.1 標準曲線的繪制 考馬斯亮藍G-250 溶液的配制：取25 mL 95%的乙醇，50 mg 考馬斯亮藍G-250，再加入60 mL 85%的磷酸，蒸餾水定容至500 mL，避光保存備用。分別吸取1.0 mg/mL 的標準蛋白質溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL 于試管中，用蒸餾水補足溶液為0.1 mL。每管加入5.0 mL 考馬斯亮藍G-250 試劑，混合均勻等待2 min，在595 nm 處測定吸光度值[21?22]。以牛血清蛋白的質量濃度（mg/mL）數為橫坐標（x 軸），595 nm下的吸光度值為縱坐標（y 軸），繪制標準曲線，建立回歸方程，得到回歸方程為y=0.5279x?0.0014（R2=0.9998）。

1.2.5.2 總蛋白的測定及提取率的計算 藜麥中總蛋白含量的測定采用凱氏定氮法，參照GB/T5009.5-2010 食品中蛋白質的測定[23]。由1.2.5.1 建立的回歸方程，計算出提取的蛋白質含量，按照式（1）計算蛋白質的提取率[24]：

式中：M1為超聲輔助提取獲得的藜麥蛋白質量，g；M2為樣品中總蛋白質質量，g。

1.2.6 藜麥蛋白功能特性測定

1.2.6.1 溶解度的測定 將提取的藜麥蛋白分別配制成濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的蛋白懸浮液，采用雙縮脲法測定其蛋白溶解性[25]，將配制好的蛋白懸浮液經10000 r/min 離心20 min，除去不溶物，取上清液1 mL 加入4 mL 雙縮脲，混勻后靜置30 min，在540 nm 波長下測定其吸光度值，進而計算上清液中藜麥蛋白濃度（mg/mL）占總蛋白濃度的百分數，計算公式如下：

1.2.6.2 乳化性及乳化穩定性的測定 參考Jiang 等[26]的方法，并稍作修改。分別取6 mL 濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的藜麥蛋白溶液，與2 mL 大豆油混合均勻。然后用高速分散機12000 r/min 乳化2 min，制成藜麥蛋白乳液，立即從燒杯底部取50 μL 乳狀液與5 mL 0.1 g/100 mL SDS 混勻，在500 nm 波長處測定吸光度A0。靜置30 min 后按相同方法測定乳狀液的吸光度A30，每組三個平行。乳化性（EA）和乳化穩定性（ES）的計算公式如下：

式中：C 表示形成乳狀溶液之前蛋白質的濃度，g/mL；φ=0.01，代表光程，θ=0.25，代表乳狀液中油所占的體積分數。

1.2.6.3 起泡性及起泡穩定性的測定 參照蔡沙等[24]的方法測定，并作適當修改。分別取10 mL 濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的藜麥蛋白溶液，于20000 r/min 高速分散器下均質1 min，讀取泡沫體積（mL），放置30 min 后再次讀取泡沫體積。起泡性（FC）和起泡穩定性（FS）按照式（5）、（6）計算：

1.3 數據處理

所有試驗均重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用Excel、SPSS Statistics 23.0 和Design-Expert8.0.6 軟件進行試驗數據的處理和顯著性分析，使用Origin2018 繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 溫度對藜麥蛋白提取率的影響 溫度對藜麥蛋白提取率的影響如圖1 所示。由圖可知，隨著溫度的升高，藜麥蛋白的提取率呈先上升后下降的趨勢，在40 ℃達到最大值為65.83%，其結果與韓宗元等[27]的研究結果趨勢一致。溫度低于40 ℃時隨著溫度的增加蛋白質分子熱運動增加，溶出率增高。40～60 ℃范圍內提取率顯著降低（P＜0.05），可能是由于高溫使部分物料略有糊化，溶液黏度變大，分子運動變慢，從而導致提取率下降[24]。因此，確定藜麥蛋白的最適提取溫度為40 ℃。

圖1 溫度對藜麥蛋白提取效果的影響Fig.1 Influence of extraction temperature on extraction effect of quinoa protein

2.1.2 超聲時間對藜麥蛋白提取率的影響 超聲時間對于藜麥蛋白提取率的影響如圖2 所示。由圖可知，0.5～2.0 h 的范圍內，藜麥蛋白的提取率顯著增加（P＜0.05），在2.0 h 時達到最大值為59.50%。這是因為隨著反應時間的延長，藜麥粉與堿性物質充分接觸，使蛋白質與纖維素等成分分離，從而導致提取率增加[28]。當超聲時間超過2.0 h 時，藜麥蛋白的提取率從59.50%逐漸下降到28.16%，可能是因為隨著超聲時間的延長，溫度升高過快，使得蛋白質顆粒之間的作用增強，易凝集而沉淀，藜麥中部分成分分解或揮發，蛋白發生變性，使藜麥蛋白的提取率下降[16]。因此，確定2 h 為藜麥蛋白的最適提取時間。

圖2 超聲時間對藜麥蛋白提取效果的影響Fig.2 Influence of ultrasionic time on extraction effect of quinoa protein

2.1.3 料液比對藜麥蛋白提取率的影響 料液比對于藜麥蛋白提取率的影響如圖3 所示。由圖可知，隨著料液比的增加藜麥蛋白的提取率呈現先上升后下降的趨勢。可能是隨著料液比的增加，溶液中的藜麥蛋白不斷溶出，當料液比到達1∶30 g/mL 時，藜麥蛋白提取率達到最大值52.74%。當料液比大于1∶30 g/mL 后，溶液中藜麥蛋白已達到飽和狀態，溶液中的蛋白溶度與藜麥蛋白組織中的濃度趨于平衡，過量的藜麥蛋白不再溶解，且料液比過大時，不利于蛋白質提取后的濃縮沉淀，所以提取率顯著下降（P＜0.05）[15]。其結果與寧芯等[29]的研究結果相一致。因此，確定藜麥蛋白的最適提取料液比為1∶30 g/mL。

圖3 料液比對藜麥蛋白提取效果的影響Fig.3 Influence of solid-liquid ratio on extraction effect of quinoa protein

2.1.4 超聲功率對藜麥蛋白提取率的影響 超聲功率對于蛋白提取率的影響如圖4 所示。由圖可知，在超聲功率100～350 W 范圍內，藜麥蛋白提取率顯著上升（P＜0.05），在350 W 時蛋白提取率達到最大值43.10%。當超聲功率超過350 W 時，藜麥蛋白提取率變化不顯著（P＞0.05）。這是因為在提取初期，藜麥蛋白沒有充分溶解，隨著超聲功率的提高，分子擴散速度逐漸變大，溶劑更容易滲透到藜麥內部，蛋白質分子滲出加快，溶出量變大[16]。當超聲波功率大于350 W 時，在固定條件下，大部分蛋白已經溶出，所以提取液中的蛋白含量沒有顯著變化（P＞0.05）。因此，確定藜麥蛋白的最適超聲提取功率為350 W。

圖4 超聲功率對藜麥蛋白提取效果的影響Fig.4 Influence of ultrasonic power on extraction effect of quinoa protein

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果 通過單因素實驗確定藜麥蛋白的最佳提取工藝參數，根據表1 中因素和水平的設計試驗，利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行優化設計，以蛋白質提取率為響應值，結果見表2。

表1 響應面自變量因素編碼和水平Table 1 Factors encoding and levels in response surface methodology

表2 超聲波輔助熱堿法提取藜麥蛋白響應面試驗設計結果Table 2 Experimental results of ultrasonic-assisted thermoalkaline extraction of quinoa protein

利用響應面軟件對溫度（A）、料液比（B）、超聲功率（C）等三個因素進行回歸擬合分析，得到如下回歸方程（Y 代表藜麥蛋白質提取率）：

回歸方程方差分析結果如表3 所示。回歸模型的參數P＜0.01，說明響應面的模型擬合較好，本次試驗的可信度高。表中可以看出模擬項A、B、C、A2和交互項AC 對藜麥蛋白提取率影響極顯著；B2對藜麥蛋白提取率影響顯著；其中失擬項P=0.421 失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型可用于分析和預測藜麥蛋白的提取率。從建立的回歸模型中可以得出各因素的影響的主次順序為：溫度＞料液比＞超聲波功率，也表明了三因素對提取蛋白的重要程度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 響應面優化提取條件 為進一步研究溫度、料液比和超聲功率各因素之間的交互作用對藜麥蛋白提取率的影響，應用Design-Expert 8.0.6 進行分析[30]。圖5 為各因素交互作用的響應面圖。圖5-a為溫度和料液比對藜麥蛋白提取率的交互作用，圖5-b為溫度和超聲功率對藜麥蛋白提取率的交互作用，圖5-c 為料液比和超聲功率對藜麥蛋白提取率的交互作用。

響應面圖可以最直觀地展示出各因素對蛋白提取率影響的大小，曲面越陡峭，說明兩因素對響應值的交互影響越大；曲面越平緩，說明兩因素對響應值的交互影響越小[31]。圖5-a 和圖5-c 兩圖曲面坡度較平緩，說明料液比與超聲功率及溫度的交互作用對于藜麥蛋白提取率的影響較小。從圖5-b 響應面可以看出曲面的坡度較陡，說明溫度和超聲功率的交互作用對于藜麥蛋白提取率的影響較大，而且溫度所對應的曲面與超聲功率相比，坡度更陡，說明溫度對藜麥蛋白提取率的影響大于超聲功率。此結果與方差分析結果一致。

圖5 各因素交互作用響應面圖Fig.5 The response surface of the interaction of various factors

通過Design-Expert8.0.6 軟件分析得出，當料液比為1∶35 g/mL、提取溫度為40.35 ℃、超聲功率為400 W 時，藜麥蛋白提取率最高為78.229%。但考慮實際操作情況，將最優提取工藝參數調整為料液比1∶35 g/mL、溫度40 ℃，超聲功率400 W。

為了檢驗響應面試驗得到的藜麥蛋白提取率模型的正確性和合理性，進行了一組驗證試驗。驗證試驗結果表明：在料液比為1:35 g/mL，超聲功為400 W，溫度為40 ℃的條件下，藜麥蛋白的提取率為78.20%。由此可知，藜麥蛋白提取率驗證試驗的實際值與模型預測值之間比較接近，說明該模型可以較準確地分析和預測藜麥蛋白的提取率。

2.3 藜麥蛋白特性研究

2.3.1 溶解度 溶解度是測量蛋白功能特性重要指標之一，它體現的蛋白質在水中分散水平，同時蛋白質的變性程度也可以通過溶解行為的變化來表示[32]。如圖6 所示，超聲輔助法提取的藜麥蛋白的溶解性，隨著蛋白懸浮液濃度的增加不斷增大，在3.5%濃度時達到最大，最大值為61.18%，在大于3.5%時，蛋白懸浮液的溶解度變化不顯著（P＞0.05），可能是因為此時溶液已達到飽和。

圖6 蛋白懸浮液濃度對藜麥蛋白溶解度的影響Fig.6 Effect of protein concentration on protein solubility of quinoa protein

2.3.2 乳化性及乳化穩定性 在高速攪拌下，蛋白與油被均勻分散在水中形成乳化液的能力叫蛋白乳化性；維持蛋白乳化液穩定且不出現明顯分層的能力即蛋白乳化穩定性，溶液pH、離子濃度、溫度和蛋白質濃度都對蛋白乳化性及乳化穩定性有不同程度的影響[33]。如圖7 所示，藜麥蛋白的乳化性和乳化穩定性隨著藜麥蛋白濃度的增加呈現先增高后降低的趨勢，在3.5%濃度時，乳化性和乳化穩定性均達到最大值分別為5.39 m2/g 和255.59 min，其結果與王棐等[28]的研究結果相比，藜麥蛋白的乳化性增加了0.18 m2/g，因此超聲輔助提取的藜麥蛋白在3.5%濃度時具有良好的乳化性及乳化穩定性。

圖7 蛋白濃度對藜麥蛋白乳化特性的影響Fig.7 Effect of protein concentration on emulsifying properties of quinoa protein

2.3.3 起泡性及起泡穩定性 蛋白起泡性是指蛋白樣品在高速攪打過程中通過降低水的表面張力，并撲捉氣體最終形成泡沫的能力；起泡穩定性指蛋白泡沫產生后保持泡沫穩定的能力[34]。不同濃度下藜麥蛋白的起泡性及起泡穩定性的變化如圖8 所示，隨著藜麥蛋白濃度的不斷增加起泡性及起泡穩定性呈現先升高后降低的趨勢，在濃度為3%時均達到最大值，分別為101.0%和66.0%，其結果與Elsohaimy等[35]的研究結果相比藜麥蛋白的起泡性增加了22.31%，穩定性相比增加了11.46%。因此，超聲輔助提取的藜麥蛋白在3%濃度時具有良好的起泡性和起泡穩定性。

圖8 蛋白濃度對藜麥蛋白起泡特性的影響Fig.8 Effect of protein concentration on foaming properties of quinoa protein

3 結論

本文以藜麥為原料，通過超聲波輔助熱堿法提取藜麥蛋白，利用單因素和響應面法優化藜麥蛋白提取工藝，確定蛋白最佳提取工藝條件為料液比1∶35 g/mL、超聲功率400 W、溫度40 ℃，超聲時間2 h，在此條件下，藜麥蛋白提取率可達到78.20%。在3.5%濃度時蛋白溶解度最好，在3.5%和3%濃度時表現出最佳的乳化性和起泡性。超聲輔助的提取藜麥蛋白的方法與其他單一的堿提酸沉法相比，提高了藜麥蛋白的提取率，同時也顯著提高藜麥蛋白的起泡性與乳化性，通過響應面優化的方法，探究出了最佳的處理工藝條件，為藜麥蛋白的改性提供了理論的基礎，但此種方法對于藜麥蛋白其他性質的影響尚需進一步的研究。