傅立葉變換紅外光譜技術對常見食源性致病菌和真菌快速分類鑒別

龔 方，劉小菁，康秋燕，汪 穎，李兆杰,

（1.中共青島西海岸新區工委軍民融合辦，山東青島 266000；2.威海職業學院，山東威海 264210；3.青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島 266000）

食源性致病菌和真菌毒素都是引起食源性疾病的主要風險因素[1]，Hermann 等[2]整理了2015 到2018 年的食品安全綜述文章，發現關于致病菌和真菌毒素的綜述研究位居常見風險因素排行的前兩位，在食品安全研究中處在首要位置，也是各國食品安全管理部門重點關注和監管的檢測項目，因此，非常有必要建立有效、準確的食源性致病菌和真菌的分類識別方法以實現快速檢測，減少其帶來的風險[3]。

近年來，光譜技術越來越多地應用于食品檢測的多個領域[4]，包括傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）[5]、拉曼光譜（Raman spectroscopy）[6]、傅立葉變換近紅外光譜（Fourier tranform near infrared spectroscopy FT-NIR）[7]等，其中，FT-IR 技術應用較早，研究也更為廣泛。早在1984 年，Naumanan 等[8]提出了該技術應用在微生物種類鑒定方面的可能，并研究了種間水平的鑒定方法[9]。FT-IR 技術主要是以完整細胞的FT-IR 光譜特殊指紋區為依據，反映不同菌種蛋白質、核酸等物質特征上的區別[10]，采集形成由多種標準菌株光譜構建成的光譜數據庫，結合化學計量分析方法，建立有效的聚類模型，實現微生物種間的分類鑒定，一般包括樣品制備、光譜采集、譜圖處理、數據分析、方法驗證等步驟[11]。FT-IR 常見應用于不同細菌的分類研究：代群威等[12]通過譜圖分析，驗證了FT-IR 技術在人體細菌與土壤細菌鑒定中的應用，慈云祥等[13]對酵母菌、細菌等微生物的分類進行了初步光譜分析，王若男等[14]研究了脂環酸芽孢桿菌等不同桿菌的種間分類鑒定，Lefier 等[15]探索了FT-IR 結合CVA 分析對單核細胞增生李斯特菌進行了亞種分類的研究，并分析了處理方法、培養時間、溫度等不同因素對鑒定結果的影響，相對來說，針對真菌分類的研究并不多見。

本文創新性地利用FT-IR 技術構建易造成食品污染的13 種常見致病菌和12 種常見真菌導數譜數據庫，結合數據分析模型，建立基于FT-IR 技術的菌種鑒定分類方法，對傅立葉紅外光譜技術在微生物鑒定領域的應用是一個新的擴展，也為微生物食品安全風險的快速檢測提供新的方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 標準菌株 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC 12826、大腸埃希氏菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）ATCC 43895、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 12600、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC 12228、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 10536、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）ATCC 51329、宋內氏志賀氏菌（Shigella sonnei）ATCC 25931、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19114、弗勞地檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）ATCC 10787、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 14028、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）ATCC 49701、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）ATCC 13047 美國模式培養物集存庫（ATCC）；腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）CICC 21482 工業微生物菌種保藏中心（CICC）；禾谷鐮孢霉（Fusarium graminearum，F.graminearum）CGMCC 3.4733、棲土曲霉（Aspergillus terricola，A.terricola）CGMCC 3.3557、黃暗青 霉（Penicillium citreonigrum，P.citreonigrum）CGMCC 3.5694、黃曲霉（Aspergillus flavus，A.flavus）CGMCC 3.6434、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus，A.parasiticus）CGMCC 3.6156、桔灰青霉（Penicillium aurantiogriseum，P.aurantiogriseum）CGMCC 3.5691、擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii，T.pseudokoningii）CGMCC 3.3002、土生鏈孢霉（Alternaria humicola，A.humicola）CGMCC 3.3907、鮮綠青 霉（Penicillium viridicatum，P.viridicatum）CGMCC 3.5690、煙曲霉（Aspergillus funigatus，A.funigatus）CGMCC 3.6452、雜色曲霉（Aspergillus versicolor，A.versicolor）CGMCC 3.6410 中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）；茄病鐮刀菌（Fusarium solani，F.solani）CPCC 460008 中國藥用微生物菌種保藏中心（CPCC）。

1.1.2 試劑與儀器 冷凍鮐鲅魚1.5 kg、辣椒粉1 kg市場購買；營養肉湯、EMB 平板、BS 平板、XLD平板、Baird-Parker 瓊脂和血平板、PDA 平板 北京陸橋生物科技有限公司，按說明書配制；無水乙醇分析純，國藥集團化學試劑有限公司；超純水 電阻18.2 MΩ，實驗室自制。

VERTEX70 傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；UV1800A 核酸蛋白分析儀 Bio-rad 公司；CR22G III 離心機 日本日立公司；IH250 恒溫恒濕培養箱、干燥箱 IRM 公司；ZnSe 窗片（透過波長7800～440 cm?1、透過率大于68%、直徑25 mm、厚度2 mm） 筱曉（上海）光子。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 細菌樣品制備 對蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC 12826 等13 種致病菌，從?70 ℃各挑取一環分別接種于營養肉湯中，（36±1）℃靜置培養18～24 h，備用。

各菌挑取活化肉湯培養物一環，接種于100 mL營養肉湯中，（36±1）℃、180 r/min 培養18～24 h，用核酸蛋白分析儀測定并記錄菌液濃度[16]，分別吸取培養物1 mL，5000×g 離心5 min，無菌生理鹽水和超純水懸浮洗滌各兩次，50 μL 超純水懸浮混勻。吸取不同稀釋度的菌懸液10 μL 于ZnSe 窗片中心，置于45 ℃干燥箱中烘干，得到干燥菌斑。每個菌株進行10 次試驗，每次3 個重復。

1.2.1.2 真菌樣品制備 對禾谷鐮孢霉（Fusarium graminearum，F.graminearum）CGMCC 3.4733 等12 種真菌，將菌種接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上進行活化，28 ℃培養3～5 d，備用。

挑取各菌活化培養物轉到新的PDA 平板上，（28±1）℃靜置培養5 d。待菌絲充足，刮下菌絲置于1 mL 無菌生理鹽水中，5000×g 離心5 min 棄上清，無菌生理鹽水和超純水懸浮洗滌各兩次，50 μL純水懸浮混勻。吸取不同稀釋度的菌懸液10 μL 于ZnSe 窗片置于45 ℃干燥箱得到干燥菌斑[17]。每個菌株進行6 次試驗，每次3 個重復。

1.2.2 光譜采集 制作好的ZnSe 窗片置于光譜儀上采集光譜信息，參數設置為：波段范圍4000～500 cm?1[18]，分辨率4 cm?1，自動扣除大氣背景，掃描次數為64 次，累計求平均[19]。

1.2.3 加標驗證

1.2.3.1 細菌加標驗證

a 供試樣品制備：取冷凍鮐鲅魚平均分為3 份，每份500 g，（121±1）℃高溫滅菌15 min，得到無菌鮐鲅魚，剪碎均質后向其中分別添加5×102CFU/mLE.coliATCC 10536、S.enteritidisCICC 21482、S.aureusATCC 12600 標準菌株溶液各10 mL，攪拌混勻，備用。

b 細菌培養：供試樣品每份稱取25 g，分別按照大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌選擇培養標準進行增菌培養。增菌后的培養液濃度盡量控制E.coli的OD600在0.85 左右，S.enteritidi的OD600在0.7左右，S.aureus的OD600在0.9 左右。

c 硒化鋅（ZnSe）窗片的制作：方法同1.2.1.1。

d 光譜采集：分別采集各菌FT-IR 光譜，光譜采集參數同1.2.2。

1.2.3.2 真菌加標驗證

a 供試樣品制備：取辣椒粉平均分為2 份，每份500 g，（121±1）℃高溫滅菌15 min，得到無菌辣椒粉，用無菌小鐵勺分別將培養好的A.flavusCGMCC 3.6434 和F.graminearumCGMCC 3.4733 菌絲從培養基上刮下，制作菌懸液添加至無菌辣椒粉中，攪拌混勻，冷凍備用。

b 真菌培養：稱取供試辣椒粉樣品25 g 均質于225 mL 無菌超純水中，分別吸取1 mL 樣品勻液于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中，倒置（28±1）℃培養5 d。

c 硒化鋅（ZnSe）窗片的制作：方法同1.2.1.2。

d 光譜采集：分別采集各菌FT-IR 光譜，光譜采集參數同1.2.2。

1.3 數據處理

1.3.1 標準菌株光譜處理和數據分析 用VERTEX70自帶的掃描分析軟件OPUS 6.5 軟件進行透過率-吸光度轉化、基線校正[20]，對波數范圍光譜一階導數（平滑點選擇17 點）運算得到導數譜后做矢量歸一處理，將歸一化后的導數譜，轉化為excel 數據格式。

將1.2.1.1 處理后的13 種細菌977.9～1805.3 cm?1波數范圍光譜數據分別導入Matlab 6.5 和Statistica 6.0 軟件，分別得到13 種致病菌導數譜的HCA 分布圖和PCA 分布圖。

將1.2.1.2 處理后的12 種真菌900～1800 cm?1和2800～3700 cm?1波數范圍光譜數據分別導入Matlab 6.5 和Statistica 6.0 軟件，分別得到12 種真菌導數譜的HCA 分布圖和PCA 分布圖。

1.3.2 加標驗證數據分析 將可疑待測菌E.coli、S.enteritidi、S.aureus977.9～1805.3 cm?1波數范圍光譜數據與1.3.1 構建的13 種致病菌光譜信息數據庫合并，選擇HCA 分析方法進行聚類分析，得到待測菌的聚類結果。

將可疑待測菌A.flavus和F.graminearum900～1800 cm?1和2800～3700 cm?1波數范圍光譜數據分別與1.3.1 構建的12 種真菌的光譜信息數據庫合并，選擇HCA 分析方法進行聚類分析，得到待測菌的聚類結果。

2 結果與分析

2.1 細菌濃度

培養18～24 h 后，根據核酸蛋白儀測定的結果，各菌種的吸光值及濃度見表1。

表1 細菌OD600 和濃度Table 1 Value of OD600 and concentration of bacteria

2.2 光譜導數譜數據庫的建立

2.2.1 細菌光譜數據庫的建立 對各菌種的導數譜取平均，得到不同菌種的平均光譜，見圖1。在圖示波數范圍內，各菌的峰形、峰位以及峰的數量差距不大，僅憑譜圖無法區別各菌種之間的差異，需建立光譜數據庫借助數據分析和化學計量學運算進行分析。

圖1 13 種致病菌平均導數譜Fig.1 Average FT-IR spectral derivatives of 13 species of pathogenic bacteria

13 種常見致病菌FT-IR 光譜數據庫的建立：根據試驗反復驗證結果，本文確定的光譜采集波數范圍為4000～500 cm?1，用于數據分析的波數范圍為977.9～1805.3 cm?1。應用OPUS 6.5 軟件對原始光譜進行預處理得到導數譜，又對導數譜進行了適量歸一化，建立了B.cereus、E.coliO157、S.aureus、S.epidermidis、E.sakazakii、S.sonnei、L.monocytogenes、C.freunddi、S.typhimurium、S.enteritidis、E.aerogenes、E.cloacae等13 種菌的FT-IR 導數譜數據庫。

2.2.2 真菌光譜數據庫的建立 對采集并處理后的各菌種的FT-IR 光譜取平均，得到各菌種的平均光譜，見圖2。由圖可見，經基線校正和矢量歸一化后，光譜間的一些差異可用肉眼區分。在選擇的900～1800 cm?1和2800～3700 cm?1波數范圍內，根據12 個菌株FT-IR 光譜圖中吸收峰所表征的意義，可將其分為5 個具有差別的光譜特征區域分別是3700～2996 cm?1處、2996～2800 cm?1處、1800～1485 cm?1處、1485～1185 cm?1處、1185～900 cm?1處，這些不同的特征區域分別反映了真菌細胞不同化學物質的伸縮振動帶，菌種不同，化學物質含量和區域分布便會不同，能夠區別一定的菌種差異。盡管光譜的一些差異可通過肉眼鑒別，為了建立的方法更系統直觀，需要建立光譜數據庫進行數據分析。

圖2 12 種真菌平均導數譜Fig.2 Average FT-IR spectral derivatives of 12 species of fungi

12 種常見真菌FT-IR 光譜數據庫的建立：應用OPUS6.5 軟件對得到的原始光譜進行轉化和基線校正，對12 種菌4000～600 cm?1波數范圍光譜進行矢量歸一化處理，即建立了F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningii、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor、F.solani等12 種真菌的FT-IR 光譜數據庫。

2.3 PCA 和HCA 分析結果

2.3.1 PCA 分析結果 通過對13 種致病菌和12 種真菌的光譜數據進行PCA 分析，發現不管用2 種主成分還是3 種主成分為聚類依據，均不能對菌種進行較好聚類。分析其原因，理論上PCA 分析可以在不降低光譜差異的前提下，減少數據維數實現直觀呈現，但減少維數也使得對在多維空間能較好分類的數據點產生交叉或重疊，導致降維后不能準確分類[21?23]，也說明PCA 方法在處理多維數據時并不具有優勢。

2.3.2 HCA 分類結果 利用皮爾森積矩相關系數算法描繪樹狀分支圖，對13 種致病菌和12 種真菌的光譜數據進行HCA 分析。如圖3 所示，13 種菌的樣本按照菌種準確聚類，樣本間沒有出現交叉和重疊，證明該分析方法能夠將圖中各菌種較好聚類，實現種間分類的目的。圖4 是12 種真菌的光譜數據樹狀聚類分布圖，每個菌種的樣本均能夠歸為一類，實現種間的準確分類。證明該方法可以適用于致病菌和真菌的菌種分類。

圖3 13 種常見致病菌 HCA 聚類樹狀圖Fig.3 HCA cluster results of FT-IR spectra of 13 species of pathogenic bacteria

同時，從圖4 可以看出，雖然每個真菌菌株紅外光譜的6 次重復都可正確地歸為一類，但真菌分類系統的層次等級不能在聚類分析圖中體現出來。例如，同屬于曲霉屬的5 個種黃曲霉、煙曲霉、棲土曲霉、雜色曲霉、寄生曲霉在第二層次“屬”的歸類中，未能同時歸于一類中。這一現象與光譜識別方法與傳統真菌分類方法依據不同有一定關系，傳統生物學方法依據的是形態學、細胞結構等，而光譜方法主要通過識別細胞生物大分子的組成。

圖4 12 種真菌HCA 聚類樹狀圖Fig.4 HCA cluster results of FT-IR spectra of 12 species of fungi

2.4 加標驗證結果

分別向無菌鮐鲅魚樣品中添加可疑待測菌，驗證所建立的13 種常見食源性致病菌的FT-IR 光譜數據庫及種間分類鑒定方法的準確性，結果見圖5。由圖可見，樣品中的E.coli、S.enteritidi、S.aureus分別準確聚類到相應的菌種中，實現了對可疑待測菌的準確鑒定。說明本文建立的光譜數據庫給可疑待測菌的種類鑒定提供了準確的歸類依據，也說明FTIR 技術結合HCA 分析建立的致病菌菌種分類鑒定方法是可行的。

圖5 致病菌加標驗證結果Fig.5 The result of adding standard to verify pathogenic bacteria

通過向無菌辣椒粉樣品中添加可疑待測真菌，驗證所建立的12 種真菌的FT-IR 光譜數據庫及種間分類鑒定方法的準確性，結果見圖6。由圖可見，可疑待測真菌A.flavus和F.graminearum分別準確聚類到數據庫中對應的菌種，驗證了方法的準確性，說明本文建立的方法能夠實現可疑待測真菌種類的鑒定，為常見真菌的菌種檢測提供了新的方法支撐。

圖6 真菌加標驗證結果Fig.6 The result of adding standard to verify suspected fungi

3 結論

FT-IR 技術簡單、快速、高效等優點，使其在微生物分類鑒定方面的作用越來越得到重視，在成分檢測、性能比對、臨床醫學等領域中的快速鑒定也得到了較多的研究[24?26]。傳統菌種鑒定方法操作繁瑣，需要進行生化實驗和血清學實驗，檢測周期約需5～7 d甚至更長。相比于傳統生物學鑒定方法，本文建立的方法具有易操作、周期短、成本低等特點。從可疑菌落到檢測結果只需要幾分鐘，整個檢測過程僅需要2～3 d，檢測所用的試劑更少，主要耗材ZnSe 窗片可重復利用。本文使用的主成分分析（PCA）和聚類分析（HCA）是對光譜數據進行描述的方法，都屬于化學計量學統計方法中的無監督型法，即在未知確切分類的情況下進行的數據分析[27]。其中，PCA 是在不降低差異同時減少維數，而后將綜合變量進行比較后畫出散點圖[28]，HCA 是根據數據本身所具有的特征進行歸類和內在結構分析，得到光譜簇間距離[29]。兩種不同方法的聚類結果各有優勢，也受到采集參數、制備條件、種間差異等因素影響[30]，同時，一些研究也發現，應用光譜方法對菌種進行鑒定，其重復性受到包括培養條件、實驗操作標準化、分析方法等因素的影響[31]，因此應確保菌種培養參數、樣品制備以及光譜分析等與建立光譜數據庫的條件保持一致[32]。

本研究確定了常見食源性致病菌的977.9～1805.3 cm?1光譜分析靈敏區，真菌的3700～2996 cm?1、2996～2800 cm?1、1800～1485 cm?1、1485～1185 cm?1與1185～900 cm?1五個光譜分析靈敏區，獲得了分辨率高、重現性好的紅外譜圖，構建光譜數據庫，通過HCA 分析將13 種細菌和12 種真菌直觀清楚地區分開來。從驗證試驗的結果來看，無論致病菌還是真菌，可疑待測菌均能聚類到各自對應的菌種光譜數據庫中，驗證了FT-IR 技術在微生物種間水平鑒定上的準確性，拓展了FT-IR 技術結合化學計量學分析方法在微生物分類鑒定方面的應用，對于開展食品中致病菌和真菌的快速檢測也具有實際應用價值。

研究中也發現了一些問題，例如，真菌的分類在屬間水平與傳統方法不同，鑒定結果的穩定性還需要進一步檢驗。下一步，應繼續開展將光譜識別應用于微生物屬間、菌株間的方法研究，增加對未知待測菌株的鑒定研究，并與傳統檢測方法進行全面比較分析，進一步檢驗方法的準確性和穩定性，使FT-IR 結合化學計量學應用于微生物分類鑒定的方法研究更加系統完善。