發酵法制備蕓豆渣可溶性膳食纖維及其抗運動性疲勞作用研究

白海軍，王 穎

（1.黑龍江八一農墾大學體育教研部，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；3.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；4.糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；5.黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江大慶 163319）

蕓豆豆渣屬于營養豐富且附加值高的雜豆天然加工副產物，其中，膳食纖維約占總含量的51%～58%，蛋白質約為16.87%～22%，脂肪含量占15%～20%，以及少量的維生素等化合物。其大部分用于飼料、食品及功能性成分前體物[1]，如若不被及時開發和利用，便會造成資源浪費和經濟損失，因此，近年來逐漸成為學者們研究的熱點。蕓豆豆渣中富含豐富的膳食纖維，具有一定的抗氧化性[2]，在機體內可產生自由基，進而達到預防癌癥、抗衰老等功效[3]，是一種天然新型保健食品原料來源。通常，豆渣中的膳食纖維可通過物理分離法、化學分離法、酶提取法和復合提取法等獲得[4?7]。為獲得多量優質的膳食纖維，廣大的研究者采用物理方法、化學方法、生物方法和復合手段等改變膳食纖維固有的結構和性能從而獲得期望的理化及功能特性[8?10]。其中，發酵法改性的優勢在于成本低、安全高效，微生物在發酵過程中產生大量酸性代謝產物，使處于酸性條件下的膳食纖維的糖苷鍵斷裂，產生新的還原性末端[11]。酵母菌和乳酸菌等微生物可通過發酵產生谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）等過氧化酶類物質清除活性氧，同時真菌自身含有的細胞壁多糖能夠清除如超氧陰離子自由基等活性氧，使得植物發酵液具有抗氧化性。蕓豆食用及藥用價值高[12]，原料選擇蕓豆渣膳食纖維發酵液既可最大程度保留植物原料的營養成分，又可通過有益微生物的代謝產生功能性小分子活性物質，賦予其多項生理功能[13]。

運動性疲勞的產生因素是多方面的，其機理緣于自由基和其他氧化物積累量過多[14]。隨著運動時間的延長，運動性疲勞感亦會逐漸增加，進而使機體運動能力降低，相關方面的研究一直都是體育科研人員孜孜追求的課題。部分研究證實，提高抗氧化劑的攝入，可清除體內多余的自由基提高體內抗氧化能力，進而緩解運動性疲勞。井宏穎等[15]通過體內抗氧化實驗，證實地黃飲子通過增加SOD 活性，提高小鼠抗氧化能力，可在一定程度上緩解運動性疲勞。也有研究表明[16]，白藜蘆醇是一種天然抗氧化劑，在體內和體外都具有的抗氧化和抗炎特性，能夠有效地緩解運動疲勞。

目前，針對蕓豆渣膳食纖維的研究多集中于提取工藝優化、部分功能特性等方面，而關于其抗疲勞性的研究頗少。本研究以蕓豆渣膳食纖維為原料，經過復合菌種發酵進行改性，建立運動性疲勞大鼠模型，并通過負重力竭游泳實驗和測定相關生化指標，研究改性后的蕓豆渣膳食纖維對緩解運動性疲勞的影響，旨在為豐富抗疲勞類功能性產品的種類和安全、綠色可持續發展利益最大化提供理論依據，也為制定全面多樣化的運動訓練飲食計劃提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4～6 周齡SPF 級雄性Wistar 大鼠50 只，初始體質量（220±20）g 遼寧長生生物技術股份有限公司，清潔級許可證號：SCXK（遼）2015-0001，飼養于SPF 級動物房，12 h/12 h 模擬循環光照，環境溫度（23±2）℃，相對濕度50%±10%。大鼠自由飲水及采食。

蕓豆渣、奶白花蕓豆 國家雜糧工程技術研究中心；堿性蛋白酶（200000 U/g）、耐高溫a-淀粉酶（20000 U/mL） 上海源葉生物有限公司；生化指標檢測試劑盒 蘇州卡爾文生物技術有限公司；其他試劑均為分析純；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸鏈球菌（Streptococcus acidophilus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus） 實驗組前期篩選。

AR2140 電子天平 常州勵岸寶機械設備科技有限公司；DL-360B 型超聲波清洗機、FD-1A-50 型冷凍干燥機、LMQ.C-50E 型高壓滅菌鍋 上海之信儀器有限公司；YC-04B 型多功能粉碎機 廣州金本機械設備有限公司；RM2016 輪轉式切片機 德國Leica 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵改性蕓豆豆渣膳食纖維提取 采用超聲輔酶法提取，具體工藝流程如下：蕓豆豆渣→脫脂→接菌發酵→熱水漂洗→烘干→粉碎→超聲輔酶脫蛋白、脫淀粉→滅酶→離心→濾液→濃縮→醇沉→發酵改性可溶性蕓豆渣膳食纖維→脫水、干燥→超微粉碎→發酵改性可溶性蕓豆渣膳食纖維粉。

操作要點：a.預處理：烘干豆渣，粉碎約30 s后過40 目篩備用。b.脫脂：豆渣與石油醚按料液比1:6 g/mL 混勻，攪拌脫脂6 h，共脫脂兩次。c.接菌發酵：植物乳桿菌、嗜酸鏈球菌、雙歧桿菌（1:1:1），料液比為1:20 g/mL，接菌量3.5%、發酵溫度37.2 ℃、發酵時間24 h、調節pH 至6。d.超聲輔酶脫蛋白、脫淀粉：準確稱取10 g 豆渣粉，按料液比1:10 g/mL加入蒸餾水，調節pH 至8，加入1%堿性蛋白酶；調節pH 至5.5，加入0.2%的耐高溫α-淀粉酶，超聲輔助下（超聲功率500 W，時間15 min，溫度50 ℃）酶解蛋白質和淀粉。e.滅酶：121 ℃，15 min。f.分離蕓豆渣可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber：SDF）：用蒸餾水沖洗濾渣，40 ℃濾液旋蒸濃縮至30 mL，1:5 體積的乙醇醇沉10 h 后抽濾，清洗膳食纖維至中性后，冷凍干燥12 h 獲SDF，超微粉碎過80 目篩，備用。

1.2.2 蕓豆渣SDF 發酵前后理化性質測定

1.2.2.1 水溶性膳食纖維含量 酶重量法，參照依據GB 5009.88-2014。

1.2.2.2 持水力測定 分別稱取0.5 g 發酵前后SDF 樣品于離心管中m1，加入定量蒸餾水，勻速攪拌20 min 后靜置30 min，4000 r/min，10 min，除去上清液，稱殘渣質量m2，按照公式（1）計算持水力[4]。

式中：m1為樣品的質量（g）；m2為殘渣質量（g）。

1.2.2.3 膨脹力測定 分別稱取1.0 g 發酵前后SDF樣品于20 mL 量筒中記錄其初始體積，加入蒸餾水，振蕩均勻，室溫下靜置24 h 后觀察量筒中物料的自由膨脹體積，按照公式（2）計算膨脹力[17]。

式中：m0為樣品的干質量（g），V1為樣品初始體積（mL）；V2為膨脹后的體積（mL）。

1.2.2.4 持油力測定 分別稱取0.5 g 發酵前后SDF樣品于50 mL 離心管中m1，加入20 mL 食用油，攪拌30 min 后靜置12 h，4000 r/min，10 min，除去上清液，稱殘渣質量m2，并按照公式（3）計算[5]。

式中：m1為樣品的質量（g）；m2為殘渣質量（g）。

1.2.3 動物實驗

1.2.3.1 大鼠模型建立 參照其它研究建模方法[18?19]，將健康的50 只大鼠隨機分為5 組，分別為空白對照組（EBS）、模型組（MBS）及發酵改性蕓豆渣SDF 低、中、高劑量組（KBS-L、KBS-M、KBSH），每組10 只，每天進行灌胃，累計灌胃30 d，具體喂藥操作劑量如表1。除空白對照組之外，其余組大鼠進行適應性游泳訓練，水溫為（25±2）℃，每周訓練周期為7 d，游泳6 d，休息1 d，累計4 周。第1 周大鼠無負重游泳訓練，時間為每天20 min，待第1 周大鼠熟悉游泳環境，第2 周、3 周無負重游泳訓練分別為30、40 min，第4 周開始負重自身體重3%鉛塊游泳到力竭，訓練30 min。大鼠力竭標準的狀態是，動作遲緩、大鼠口鼻沉入水中時間大于10 s，然后，迅速撈起。

表1 實驗動物灌胃藥劑分配Table 1 Distribution of drugs by gavage in experimental animals

1.2.3.2 負重力游泳實驗 將訓練4 周后的大鼠進行實驗，空白組大鼠置于相同溫度淺水中，不進行游泳；同時，記錄并比較實驗組大鼠負重力竭的游泳時間，即開始游泳時間至力竭時間。

1.2.3.3 部分生理指標測定 負重力游泳實驗結束后立刻將大鼠處死，立即眼眶取血，3000 r/min，離心15 min，將上清血清置于?80 ℃保存備用。利用試劑盒檢測大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脫氫酶（LDH）；使用試劑盒測定大鼠肝臟中的肝糖原和后腿部骨骼肌的肌糖原。

1.3 數據處理

實驗數據采用SPSS 20.0 統計學軟件分析處理，每組實驗指標測定均重復3 次，實驗數據以（均值±標準差）表示，組間兩兩差異比較進行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05、P＜0.01 分別表示結果有顯著性差異和極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 改性蕓豆渣SDF 理化性質的變化

由表2 可以看出經過復合菌發酵改性后的奶白花蕓豆豆渣SDF 含量為18.32%，比發酵前提高了12.38%。復合菌種在蕓豆可溶性膳食纖維發酵過程中不但可以減少蛋白質和淀粉等大分子物質的含量，也可分泌纖維素酶將不溶性膳食纖維（IDF）分解為SDF，使得SDF 的含量顯著提高（P＜0.05）。同時，從表中數據得知，蕓豆SDF 經微生物發酵后，持水力、膨脹力、持油力均顯著提高（P＜0.05）。其中，持水力提高了1.43 倍，數值為4.97 g/g；膨脹力為3.83 mL/g、持油力為1.24 g/g，分別提高了80.66%和58.97%。植物乳桿菌、雙歧桿菌等有益發酵細菌使得SDF 的結構糖苷鍵降解，結合位點和接觸面增多，故而結構由緊密變成松散，提高其與水、油的相互作用[20]。由此可知，復合細菌菌種發酵可以改善蕓豆SDF 的理化性質。

表2 蕓豆豆渣發酵前后SDF 理化性質的變化（± n，n=3）Table 2 Changes in physicochemical quality of SDF of bean dregs before and after fermentation (±n,n=3)

表2 蕓豆豆渣發酵前后SDF 理化性質的變化（± n，n=3）Table 2 Changes in physicochemical quality of SDF of bean dregs before and after fermentation (±n,n=3)

注：同列不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）。

2.2 改性蕓豆渣SDF 對大鼠體重、游泳力竭時間的影響

如表3 所示，4 周后疲勞型大鼠建模成功后，模型組與空白對照組的大鼠體重差異較顯著（P＜0.05）。KBS-H 與模型組相比，常態體質量差異不顯著（P＞0.05）；KBS-M、KBS-L 與模型組相比，體重差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義。與空白組相比，模型組和受試組體重略有下降，表明大鼠力竭實驗消耗部分能量，體現在體重減輕，說明運動性疲勞大鼠建模成功。通過大鼠的游泳力竭時間可以看出，模型組的運動時間極顯著低于空白組（P＜0.01）；與模型組相比，發酵改性蕓豆渣SDF 高、中、低劑量組游泳力竭時間極顯著延長（P＜0.01），表明發酵改性后的蕓豆膳食纖維具有抗運動性疲勞能力。

表3 蕓豆豆渣發酵改性SDF 對大鼠體重、游泳力竭時間的影響（ ±n，n=3）Table 3 Effects of SDF of soybean dregon body weight and swimming exhaustion time of rats before and after fermentation(±n,n=3)

表3 蕓豆豆渣發酵改性SDF 對大鼠體重、游泳力竭時間的影響（ ±n，n=3）Table 3 Effects of SDF of soybean dregon body weight and swimming exhaustion time of rats before and after fermentation(±n,n=3)

注：與空白組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比#P＜0.05，##P＜0.01。表4～表5同。

2.3 改性蕓豆渣SDF 對大鼠SOD、GSH-PX、MDA、LDH 活性影響

運動疲勞使得體內無氧呼吸強度增加、自由基積聚、抗氧能力減弱，人體的內環境穩定性受到影響[21]。與空白組相比，本實驗中模型組、劑量組中MDA、SOD、LDH 含量具有極顯著差異（P＜0.01）；GSH-Px 含量具有顯著差異（P＜0.05），說明大鼠建模成功。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶可清除體內自由基，提高二者活性，有助于人體抗氧化性提高[22]。模型組中SOD 與空白組差異極顯著，GSH-Px 差異顯著（P＜0.01，P＜0.05），表明運動后大鼠的兩種酶活力下降。高、中、低劑量組的SOD 活性較于模型組分別提高了25.58%、12.95%、6.17%，其中高劑量組有極顯著差異（P＜0.01）；高、中、低劑量組的GSH-PX 活性與模型組相較各提高25.25%、18.79%、10.65%，且差異顯著（P＜0.05，P＜0.01），同時，KBS-H 的GSH-Px 含量高于模型組，以上結果表明改性后的蕓豆SDF 能誘導這兩種酶活性增強，從而保護機體免受氧化損傷。這表明改性蕓豆渣膳食纖維能夠提高大鼠的抗疲勞能力，可以修復運動損傷。

MDA 含量是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數，可以反映機體脂質過氧化速率和強度，也能間接反映組織過氧化損傷程度，數值越小氧化程度越小[23]。在本實驗中，從表4 可以看出，與模型組相比，高、中、低劑量組MDA 均極顯著減少（P＜0.01），其中，高劑量組的膳食纖維抗運動性疲勞效果更明顯。身體中骨骼肌、腎臟LDH 的含量較高[24]，運動時，血液糖酵解致使肌肉中積累大量乳酸，乳酸脫氫酶含量提升會降低乳酸含量。本研究中，較模型組而言，低、中、高劑量組LDH 含量均減少，其中高劑量組顯著降低（P＜0.05），這表明膳食纖維可降低乳酸產生含量進而抑制乳酸脫氫酶活性，延緩疲勞產生。

表4 各組大鼠MDA、SOD、GSH-Px、LDH 比較（± n，n=3）Table 4 Comparison of MDA,SOD,GSH-Px and LDH in each group rats (±n,n=3)

表4 各組大鼠MDA、SOD、GSH-Px、LDH 比較（± n，n=3）Table 4 Comparison of MDA,SOD,GSH-Px and LDH in each group rats (±n,n=3)

2.4 改性蕓豆渣SDF 對大鼠肝糖原及肌糖原的影響

劇烈運動時，骨骼肌內的葡萄糖和肝臟內的糖原作用于肌肉和全身為機體提供能量，故而肌糖原與肝糖原變化情況可衡量運動的疲勞程度[25]。改性后的蕓豆渣SDF 對大鼠肌糖原和肝糖原的影響如表5所示。與空白組相較，模型組的肝糖原和肌糖原值差異極顯著（P＜0.01），這表明運動性疲勞會導致小鼠肝糖原與肌糖原含量顯著降低。高劑量蕓豆渣膳食纖維組較模型組相比肝糖原、肌糖原極顯著提高（P＜0.01），中劑量組顯著提高（P＜0.05）；同時，高劑量組與空白組相比差異顯著（P＜0.05）。通過上述結果，說明改性后的蕓豆渣膳食纖維可以增加大鼠肝糖原和肌糖原的儲存能力，進而增強持續性運動的耐受力。

表5 大鼠肝糖原及肌糖原（± n，n=3）Table 5 Hepatic glycogen in muscle and muscle glycogen in liver of rats (±n,n=3)

表5 大鼠肝糖原及肌糖原（± n，n=3）Table 5 Hepatic glycogen in muscle and muscle glycogen in liver of rats (±n,n=3)

3 討論與結論

本研究中蕓豆膳食纖維經過復合菌發酵改性后測定其理化值可以明確，發酵可提高膳食纖維的物化特性和得率，使得其對水和油的吸附、保留能力增強，這與涂宗財等[26]的研究結論基本一致。發酵改性促進蕓豆膳食纖維提高水溶性和穩定性，這為后續開發相關抗疲勞功能性產品解決關鍵性技術問題。隨著“全民健康，全民運動”的發展理念深入人心，有關緩解運動性疲勞的研究機理十分契合。

當人體能量和氧氣供應不足或不及時時，造成運動性疲勞，氧化反應增強，因此需要提高抗氧化劑的攝入，加強還原反應，進而清除或抑制自由基，修復氧化損傷[27]。大鼠血清中的指標MDA、SOD、GSH-Px 反映抗氧化和清除自由基的能力，可用于評估疲勞和健康狀況[28]。本實驗大鼠體內相關指標的檢測結果表明改性后的蕓豆渣膳食纖維具有較好的抗氧化功效；與模型組相比較，攝入的膳食纖維越多，大鼠抗氧化能力越強。研究者對富硒大豆肽抗疲勞性進行研究，抗氧化性指標SOD 酶、GSH-Px 酶活性相較于模型組顯著提高，MDA 含量顯著降低（P＜0.05），這與本文天然性植物膳食攝入的抗氧化性結果相一致[29]。有研究表明蕓豆具有抗氧化性，并且經過發酵改性后，抗氧化性優于發酵前[30]。本研究中經過發酵后的蕓豆膳食纖維的SOD 和GSH-Px 酶活力均提高25%左右，同時高劑量組能夠緩解力竭大鼠疲勞性，這可能與發酵改性有關，增加相應酶活性。高鵬[31]的研究證實了甜菜渣膳食纖維能夠降低蒙古馬運動期間的疲勞程度，提高運動性能。集中于對膳食纖維影響運動機制的研究相對較少，后續的研究可進一步針對此方面開展。

人體攝入能量后，將葡萄糖轉化為糖原儲存在體內，為人體供能。劇烈運動時需要分解大量肝糖原和肌糖原提供能量。相關研究證實，醇類物質[28]、蛋白質和多肽[32?34]、中藥中的活性成分[35]等可以通過提高肝糖原、肌糖原的含量，維持血糖平衡，改善運動性疲勞。本文中發酵改性后蕓豆膳食纖維提高了模型大鼠肝糖原和肌糖原，這與其他研究結果一致，表明其攝入體內有助于肌糖原和肝糖原的儲備，增強機體對運動負荷耐受能力的功效與抗疲勞能力。

綜上所述，經過發酵法改性后的蕓豆豆渣可溶性膳食纖維可以提高運動性大鼠的抗氧化損傷和肌肉組織代謝能力，緩解并改善運動性疲勞，可作為無毒害和副作用的新型抗氧化和抗疲勞原料，添加到運動員功能性產品中，對開發抗疲勞性產品具有重要意義。