補骨脂乙醇提取物活性成分與抗氧化及膽酸鹽結合能力的關聯性分析

姜欣洋，梁金月，史繼童，劉蘭玲，張珊珊，趙 盼，顏培正，趙東升,

（1.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南 250355；2.山東中醫藥大學實驗中心，山東濟南 250355）

補骨脂（Psoralea corylifoliaL.）是一種豆科補骨脂屬草本植物，主產于云南西雙版納和四川金沙江流域[1?3]，被廣泛應用于保健食品領域，如其乙醇提取物已作為食品添加劑用于泡菜等食品的加工生產[4?6]。其種子或果實具有重要的藥理活性，中醫臨床常用其治療由腎陽不足引起的陽痿遺精、遺尿尿頻、腰膝酸痛等疾病[7]。文獻調研表明其具有抗氧化、降膽固醇、抗炎和免疫調節等生理活性[2,8]，這主要與其所含有的黃酮類、單萜酚類、酚類苯桂酸等成分有關[6,9]。不同極性溶劑可以顯著地影響植物提取物的主要化學成分含量和功效[10?11]，目前，國內外有對補骨脂總黃酮提取方法及提取工藝和補骨脂不同濃度乙醇提取物干預小鼠前列腺增生作用差異的研究[12?14]，并有研究報道補骨脂乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用[15]，但鮮有補骨脂不同濃度乙醇提取物中的主要活性成分含量及其體外抗氧化與降脂功效的比較研究。

中藥成分復雜多樣，通過將成分含量與生物活性進行關聯分析，可以初步篩選活性組分和評價質量[16?17]。因此，本實驗在“成分-功效”關聯模式下，采用不同濃度乙醇分別提取補骨脂，進行總黃酮與總多酚含量比較，利用ABTS+·清除率、DPPH·清除率、還原能力和膽酸鹽結合率體外實驗開展抗氧化和降血脂能力評估，通過相關性分析建立補骨脂不同濃度乙醇提取物主要活性成分-體外抗氧化/降脂功效的評價模型，旨在為補骨脂在保健食品、藥物等應用領域的進一步研究和資源利用提供必要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

補骨脂（四川）安徽亳州中藥材批發市場，經山東中醫藥大學張永清教授鑒定為豆科補骨脂屬植物補骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實；2,2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）純度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鐵氰化鉀 純度≥99.5%，天津市巴斯夫化工有限公司；膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉鹽 純度≥98%，上海凱為化學科技有限公司；蘆丁 純度大于98%，上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、無水乙醇 均為國產分析純。

KQ-500GVDV 雙頻恒溫數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；X-5 紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司；RH-QG 全溫光照振蕩器常州市金壇精工儀器設備有限公司；FA1204B 電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；ST16R 高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 補骨脂不同濃度乙醇提取物制備 將補骨脂自然晾干，粉碎，過60 目篩。準確稱取補骨脂粉末4 份，每份40 g，分別置于錐形瓶中，按1:40 g/mL 料液比分別加入無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇和水，參考魯憲坤等[13]的方法進行提取，抽濾，濾液濃縮至浸膏狀，分別用相應溶劑溶解定容至100 mL，即得提取物溶液（相當于原藥材0.4 g/mL）。

1.2.2 總黃酮、總多酚含量測定 分別取無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液0.1 mL 置于10 mL容量瓶中，參考裴文清等[18]的方法測定。配制質量濃度為0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL 的蘆丁標準溶液，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=12.416C+0.0092，r=0.9990（A 為吸光度值；C 為蘆丁質量濃度：mg/mL）。結果以每克補骨脂粉末中所含蘆丁當量（mg/g）表示。

分別移取無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液0.1 mL 置于10 mL容量瓶中，參考崔施展等[19]的方法測定。配制質量濃度為0、0.001、0.003、0.005、0.007、0.009 mg/mL 的沒食子酸標準溶液，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=96.11C+0.0203，r=0.9991（A 為吸光度值；C 為沒食子酸質量濃度：mg/mL）。結果以每克補骨脂粉末中所含沒食子酸當量（mg/g）表示。

1.2.3 不同濃度乙醇提取物的抗氧化活性測定

1.2.3.1 ABTS+·清除能力測定 分別移取濃度為2、4、6、8、10 mg/mL 無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液和VC溶液0.5 mL 于10 mL 的離心管中，參考楊美蓮等[20]的方法測定。按式（1）計算清除率。

式中：A0為0.5 mL 乙醇溶液代替樣品溶液的吸光度值；A1為樣品組吸光度值；A2為4 mL 無水乙醇代替ABTS 溶液的吸光度值。

1.2.3.2 DPPH·清除能力測定 分別移取濃度為2、4、6、8、10 mg/mL 無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液和VC溶液2 mL 于10 mL 的離心管中，參考慕鈺文等[21]的方法測定。按式（2）計算清除率。

式中：A0為2 mL DPPH 溶液加入2 mL 乙醇溶液的吸光度；A1為2 mL 樣品溶液加入2 mL DPPH溶液的吸光度；A2為2 mL 樣品溶液加入2 mL 無水乙醇的吸光度。

1.2.3.3 還原能力的測定 分別移取濃度為2、4、6、8、10 mg/mL 無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液和VC溶液0.5 mL 于10 mL 的離心管中，參照黎善銘等[22]的方法測定。吸光度值越高，表明其還原能力越強。

1.2.4 結合膽酸鹽實驗 分別移取質量濃度為2、4、6、8、10 mg/mL 四種提取液0.5 mL 于3 支50 mL離心管中，各加入4 mL 的膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和甘氨膽酸鈉溶液（0.6 mmol/L），參考李珊等[23]的方法測定。按式（3）計算結合率。

式中：A0為0.5 mL 對應溶劑加入4 mL 膽酸鹽的吸光度；A1為0.5 mL 樣品溶液加入4 mL 膽酸鹽溶液的吸光度；A2為0.5 mL 樣品溶液加入4 mL 磷酸緩沖液的吸光度。

1.3 數據處理

以上實驗均平行操作三次，數據以 Xˉ±SD 表示。采用SPSS 26.0，GraphPad Prism 8.0.1 進行數據處理和繪圖，使用Pearson 相關性分析。

2 結果與分析

2.1 補骨脂不同濃度乙醇提取物中總黃酮和總多酚含量分析

由表1 可知，補骨脂不同溶劑提取物中總黃酮和總多酚含量存在顯著性差異（P＜0.05），總黃酮和總多酚含量隨著溶劑極性的增大而降低，與慕鈺文等[21]研究花椒籽不同濃度乙醇提取物中總多酚含量變化規律相似，根據相似相溶原理推測此變化趨勢是由于補骨脂中黃酮和多酚多屬于低極性物質所致。總黃酮含量范圍為（5.980±0.023）～（50.317±0.018）mg/g，其中，無水乙醇提取物中總黃酮含量最高，達到（50.317±0.018）mg/g，其次是75%乙醇提取物和50%乙醇提取物，水提取物總黃酮含量最少，四者之間差異性顯著（P＜0.05），與李婧雯等[24]研究的蒲公英根不同溶劑提取物黃酮含量變化規律相似；總多酚含量范圍為（3.860±0.045）～（1.877±0.003）mg/g，無水乙醇和75%乙醇提取物中總多酚含量相近，分別為（3.860±0.045）和（3.670±0.007）mg/g，顯著高于50%乙醇提取物和水提取物（P＜0.05）。

表1 補骨脂不同濃度乙醇提取物中總黃酮和總多酚含量Table 1 Contents of total flavonoids and polyphenols of different ethanol extracts from Psoralea corylifolia L.

2.2 補骨脂不同濃度乙醇提取物抗氧化活性分析

2.2.1 補骨脂不同濃度乙醇提取物對ABTS+·清除作用的比較 由圖1-A 可以看出，補骨脂不同濃度乙醇提取物對ABTS+·均具有一定的清除能力，當樣品溶液濃度在2～8 mg/mL 時，各提取物對ABTS+·清除率隨濃度的增大而增大，在8～10 mg/mL 范圍內，清除率達到平穩狀態。當質量濃度為10 mg/mL 時，各提取物清除率均達到97%左右，但小于VC對照組。由圖1-B 可知，各提取物清除ABTS+·的IC50值均大于VC對照組，50%乙醇提取物清除ABTS+·的IC50值為0.76 mg/mL，顯著低于其他三種溶劑的IC50值（P＜0.05），其次是無水乙醇、水、75%乙醇提取物，其IC50值分別為2.68、2.94、3.11 mg/mL，因此，50%乙醇提取物清除ABTS+·能力最強，經分析可能是由于50%乙醇提取物存在多糖等其他活性成分，導致其總活性成分含量較高更易于清除ABTS+·，這與師聰等[25]的實驗結果一致，即50%乙醇草果提取物清除ABTS+·能力最強。

圖1 不同濃度乙醇提取物清除ABTS+·能力（A）及其IC50（B）Fig.1 ABTS cationic radical scavenging abilities (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

2.2.2 補骨脂不同濃度乙醇提取物對DPPH·清除作用的比較 由圖2-A 可知，提取物的DPPH·清除率均小于VC對照組且相互之間差異性顯著（P＜0.05），在濃度為2～8 mg/mL 范圍內，各提取物對DPPH·清除率隨著濃度的增大具有上升趨勢，在8～10 mg/mL范圍內，清除率增加緩慢。當濃度為10 mg/mL 時，無水乙醇和50%乙醇提取物對DPPH·清除率分別達到93.21%和92.64%，其次為75%乙醇和水提取物，清除率分別達到87.37%和79.15%。由圖2-B可知，各提取物清除DPPH·的IC50值均大于VC對照組，無水乙醇和50%乙醇提取物清除DPPH·的IC50值最小，分別是1.89 和1.63 mg/mL，其次是75%乙醇和水提取物，IC50值分別為3.58 和3.89 mg/mL，因此，50%乙醇提取物對DPPH·清除能力最強，這與覆盆子50%乙醇提取物清除DPPH·能力最強報道結果一致[26]，此結果可能是由于除黃酮多酚外，其他活性物質也參與抗氧化體系所導致。

圖2 不同濃度乙醇提取物清除DPPH·能力（A）及其IC50（B）Fig.2 DPPH free radical scavenging abilities (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

2.2.3 補骨脂不同濃度乙醇提取物還原能力的比較由圖3-A 可知，VC的還原能力最大，VC濃度為2～10 mg/mL 時，還原能力基本維持在3.5 以上。在濃度為2～10 mg/mL 時，各提取物的還原能力隨提取物濃度的增加而升高。當樣品濃度為10 mg/mL 時，無水乙醇、75%乙醇和50%乙醇提取物的還原力分別為0.84、0.82、0.65，而水提取物還原能力較弱，還原力基本維持在0.1～0.25 之間。由圖3-B 可知，各提取物還原力為0.5 時對應的提取物質量濃度（A0.5）均大于VC對照組，不同濃度乙醇提取物還原能力的A0.5值大小順序為：水＞50%乙醇＞75%乙醇＞無水乙醇，這表明無水乙醇提取物還原能力最好，A0.5值為2.63 mg/mL，顯著低于其他三種溶劑提取物的A0.5（P＜0.05），這與李春愛等[27]對橄欖果渣還原能力的研究結果相似，即隨著提取物乙醇濃度增大還原能力逐漸增大，這可能是由于乙醇含量較多的提取物中總黃酮和總多酚含量較多導致其還原能力較強。

圖3 不同濃度乙醇提取物還原能力（A）及其A0.5（B）Fig.3 Reducing capacity (A) and their A0.5 values (B) of different ethanol extracts

2.3 補骨脂不同濃度乙醇提取物對膽酸鹽結合能力比較

膽酸鹽可以通過“肝腸循環”進行再利用，通過結合膽酸鹽，膽酸鹽無法完成“肝腸循環”，肝臟將更多的膽固醇轉化成膽汁酸，因而間接地降低膽固醇，進而達到降脂目的[28?29]。膽酸鹽可分為游離型膽酸鹽和結合型膽酸鹽[30]，本實驗選擇游離型膽酸鹽（膽酸鈉）和結合型膽酸鹽（牛磺膽酸鈉，甘胺膽酸鈉）開展研究。

如圖4-A 所示，各提取物對膽酸鈉都具有一定的結合能力，結合率隨著樣品濃度的增加而升高，當樣品濃度達到10 mg/mL 時，無水乙醇提取物對膽酸鈉的結合能力較大，結合率達到73.14%，其次為水、50%乙醇和75%乙醇提取物，結合率分別為61.98%、58.30%和46.09%。由圖4-B 可以看出，無水乙醇、75%乙醇和50%乙醇、水提取物對膽酸鈉的IC50值分別為3.63、20.42、6.98 和0.67 mg/mL，所以水提取物對膽酸鈉的結合能力最強，其次為無水乙醇提取物、50%乙醇提取物和75%乙醇提取物，并且四種溶劑膽酸鈉結合能力存在顯著性差異（P＜0.05），可能與水提取物中多糖成分含量較高更易與游離膽酸鹽結合有關，這與林沛純等[31]的研究結果相似，即巖藻聚糖粗多糖對三種膽酸鹽中的水合膽酸鈉結合能力最大。

圖4 不同濃度乙醇提取物結合膽酸鈉能力（A）及其IC50（B）Fig.4 Sodium cholate binding capacity (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

從圖5-A 可以看出，各提取物對牛磺膽酸鈉均有一定的結合能力，并且在2～10 mg/mL 濃度范圍內，隨實驗濃度提高結合率逐步增大。當濃度為10 mg/mL時，50%乙醇提取物對牛磺膽酸鈉的結合率達到79.56%，并高于10 mg/mL 裙帶菜多糖對牛磺膽酸鹽的結合率（52.3%）[32]。由圖5-B 可知，不同溶劑提取物結合牛磺膽酸鈉的IC50值大小順序：水提取物＞無水乙醇提取物＞75%乙醇提取物＞50%乙醇提取物，表明50%乙醇提取物對牛璜膽酸鈉的結合能力最強，IC50值為1.26 mg/mL，顯著低于水提取物的IC50值為4.36 mg/mL（P＜0.05），但其余兩種提取物之間差異并不顯著（P＞0.05）。經分析可能是由于50%乙醇提取物中除總黃酮和總多酚外，還有多糖等其他活性成分也參與了牛磺膽酸鈉的結合體系[29,33]。

圖5 不同濃度乙醇提取物結合牛璜膽酸鈉能力（A）及其IC50（B）Fig.5 Sodium taurocholate binding capacity (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

由圖6-A 可以看出，各提取物對甘胺膽酸鈉均有一定結合能力，并且在2～10 mg/mL 濃度范圍內，隨實驗濃度提高結合率逐步增大。當濃度為10 mg/mL時，50%乙醇提取物對甘胺膽酸鈉的結合能力最強，結合率達到70.97%，與體積濃度為1.0 mL/mL 的藥桑葡萄酒對甘胺膽酸鈉結合率69.36%結果相近[34]。由圖6-B 可以看出，50%乙醇提取物和無水乙醇提取物對甘胺膽酸鈉的IC50值較小，分別為0.41 mg/mL和2.07 mg/mL，顯著低于其他兩種溶劑（P＜0.05），所以50%乙醇提取物對甘胺膽酸鈉結合能力最強，其次是無水乙醇提取物，其余兩種提取物結合能力相對較弱。

圖6 不同濃度乙醇提取物結合甘胺膽酸鈉能力（A）及其IC50（B）Fig.6 Sodium glycocholate binding capacity (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

2.4 補骨脂不同濃度乙醇提取物中活性成分與抗氧化及膽酸鹽結合能力的相關性分析

測定不同濃度乙醇提取物中總黃酮和總多酚含量，通過相關性分析探究活性成分含量與抗氧化及膽酸鹽結合能力的關聯性，初步建立補骨脂不同濃度乙醇提取物主要活性成分-體外抗氧化/降脂功效評價模型。從表2 可以看出，總黃酮含量與DPPH·清除率、牛磺膽酸鈉結合率呈顯著性正相關（P＜0.05）；總黃酮、總多酚含量與還原能力均呈極顯著正相關（P＜0.01），與張天鳳等[35]的研究報道亞麻籽粕提取物總黃酮、總多酚含量與還原能力均呈顯著性正相關結果一致；總多酚含量與膽酸鈉結合率呈顯著性負相關（P＜0.05）；ABTS+·清除率和甘胺膽酸鈉結合率與總黃酮和總多酚含量相關性較低。上述結果表明，補骨脂中總黃酮和總多酚均有一定的抗氧化和降脂活性，總黃酮的抗氧化和結合膽酸鹽能力更強。

表2 補骨脂活性成分含量與抗氧化活性和膽酸鹽結合率的相關性分析Table 2 Correlation analysis between the contents of active components and antioxidant activity and cholate binding rate of Psoralea corylifolia L.

3 結論

本研究選用不同濃度乙醇溶劑提取補骨脂，其主要活性成分含量、體外抗氧化活性及膽酸鹽結合能力之間差異顯著（P＜0.05）。實驗結果表明，補骨脂不同乙醇濃度提取物的總黃酮和總多酚含量范圍分別為（5.980±0.023）～（50.317±0.018）mg/g 和（1.877±0.003）～（3.860±0.045）mg/g，其中，無水乙醇提取物總黃酮和總多酚含量均最高。50%乙醇提取物具有最強的ABTS+·和DPPH·清除能力，其次是無水乙醇提取物，而無水乙醇提取物還原能力最強。補骨脂水提取物對膽酸鈉的結合能力最強，50%乙醇提取物對牛磺膽酸鈉和甘胺膽酸鈉的結合能力最強。相關性分析表明，補骨脂不同濃度乙醇提取物中總黃酮含量與DPPH·清除率、牛磺膽酸鈉結合率呈顯著正相關性（P＜0.05），總黃酮、總多酚含量與還原能力均呈極顯著性正相關關系（P＜0.01），總多酚含量與膽酸鈉結合率呈顯著性負相關（P＜0.05），總黃酮和總多酚含量與ABTS+·清除率和甘胺膽酸鈉結合率相關性較低。同時，推測補骨脂中除黃酮和多酚外，多糖等其他重要活性成分也具有良好的抗氧化及降脂活性，需要進一步測定補骨脂中其他活性成分含量并進行分析，為補骨脂作為抗氧化和降脂物質提供一定的指導作用。