學習記憶通路抑制劑T-5224和KN-62對翹嘴鱖c-fos及味覺受體t1r1表達的影響

肖倩倩 梁旭方 莊武元 蔡文靜

(1.華中農業大學水產學院,華中農業大學鱖魚研究中心,武漢 430070;2.長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展教育部工程研究中心,武漢 430070)

學習和記憶是所有動物普遍存在的特征。動物通過學習和記憶使其靈活地適應不斷變化的環境條件,其中重要的是通過學習記憶獲得新的覓食技能[1]和食物偏好[2—4]。動物的學習記憶過程涉及動物的多個行為過程,包括攝食行為、集群行為、個體識別及信息傳遞等[5—7]。盡管學習記憶研究主要是在哺乳動物和鳥類中[8],但也有研究報道,魚類中各種行為活動都受到學習記憶的影響[9]。在魚類適應環境的過程中面臨諸多挑戰,例如避免被捕食者捕食,尋找食物及配偶選擇等。為此魚類憑借以往經驗,通過化學信號學習并判斷新捕食者的威脅程度[10],魚類通過空間記憶和社會學習增強了對捕食者的規避能力。魚類通過學習顯著提高了攝食效率[3,7],還能增強鑒定合適配偶的能力[3,11]。在這些魚類行為中,學習和記憶對魚類的攝食行為中起著決定性的作用。最近的幾項研究表明,在大麻哈魚(Onco-rhynchus keta)[12]、孔雀魚(Poecilia reticulata)[13]、褐鱒(Salmo trutta)[14]等魚可以通過學習記憶提高攝食效率及攝食偏好,而學習記憶能否在魚類攝食偏好,如馴食等過程中發揮作用,目前尚不明確。

學習記憶相關基因之一的原癌基因c-Fos(proto-oncogenec-Fos) 的表達是小鼠(Mus musculus)海馬區依賴性非空間記憶的形成和反復記憶所必需的[15]。有研究表明這c-fos基因的mRNA表達水平隨著長期記憶等神經元激活反應而上升[16]。早期研究發現動物的T1R (taste receptor type 1,T1R) 基因家族缺失或突變,以適應其特殊的攝食習性,例如大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)[17,18]。以上研究表明動物能夠通過位于味蕾上的鮮味受體感知食物的鮮味,從而影響動物的攝食及食性偏好。有研究揭示團頭魴體內鮮味受體t1r1(taste receptor type 1 member 1,t1r1)缺失,以適應植物食性[19]。通過草魚轉食前后的轉錄組數據發現,鮮味受體t1r1的基因表達也發生了顯著變化,

表明t1r1可能參與草魚食性分化過程中的調控。然而,學習記憶影響魚類攝食及食性的過程中是否存在學習記憶相關基因c-fos對味覺受體t1r1表達的調控以及如何調控,仍不清楚。有報道稱外界環境的變化可以通過表觀遺傳調控,尤其是DNA甲基化,影響基因的轉錄,最終改變魚類的表型性狀。例如通過基因控制區CpG島的甲基化來調節基因轉錄的啟動[20,21]。

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)食性奇特,自魚苗開口起就以活魚蝦為食,經過長期的馴化后才可以接受人工飼料[22],而長期馴食過程中的學習記憶促進了翹嘴鱖食性從活魚轉變為飼料[23]。何珊等[24]對雜交鱖馴食性狀的轉錄組分析,發現學習通路中cfos基因差異表達。同時實驗室前期研究發現易馴食鱖與易馴食飼料鱖腦中味覺受體t1r1的mRNA表達及其啟動子甲基化模式與不易馴食鱖完全不同[25]。因此,本實驗以翹嘴鱖為研究對象,利用學習記憶通路相關抑制劑T-5224和KN-62處理鱖腦細胞,研究c-fos是否對味覺受體基因c-fos的表達存在調控作用及調控方式,為進一步探討學習記憶對魚類攝食調控的分子機制,并為改進翹嘴鱖人工飼料馴化技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物:實驗用魚為翹嘴鱖(體重100 g左右)取自華中農業大學鱖魚研究中心,用于后續分離翹嘴鱖腦細胞。實驗開始之前先將翹嘴鱖轉移到循環水養殖系統內暫養1周,魚缸水體體積為100 L,曝氣水養殖,水體pH維持在6.8—7.2,溶解氧含量維持在6.8—7.8 mg/L,每日正常投喂餌料魚,換水吸污,以維持翹嘴鱖穩定正常生理狀態。

主要試劑:DL 2000 Marker(TaKaRa)、胎牛血清 (Fatal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶、L15培養液 (Genom)、I型膠原酶 (Gibco)、兩性霉素B、硫酸慶大霉素、青鏈霉素雙抗 (HyClone 公司)、DPBS、Dimethyl sulfoxide (DMSO Sigma)、T-5224 (Med-ChemExpress)、KN-62 (MedChemExpress)

1.2 分離翹嘴鱖腦細胞

選取一尾狀態比較好的翹嘴鱖,用75%的酒精消毒,在超凈工作臺里剖取腦組織于 DPBS 中清洗,用剪刀鑷子去除多余的組織,然后將腦組織放入盛有AIM液的培養皿內浸泡消毒1.5h;吸掉培養皿中多余AIM液,用剪刀將腦組織剪成1 mm3大小的組織塊,將組織塊轉移到盛有膠原酶消化液的離心管中在28℃培養箱中消化2h;加入L15培養液輕輕吹打得到腦細胞,1000 r/min 室溫離心5min后棄上清,隨后再用L15培養液漂洗兩次(1000 r/min,室溫離心5min),最后將收集的腦細胞加入原代培養液重懸后接種到細胞培養瓶,于 28℃無CO2培養箱中培養,第4天更換原代培養液1次。在顯微鏡下觀察腦細胞的生長情況。本課題組已經采用Neu-N和β-tubulin免疫熒光細胞化學技術鑒定了腦細胞神經元純度[26]。在腦原代細胞分離至第三代之后,即進行實驗。將腦細胞擴大培養,鋪板至6孔板中,每個孔盛放2.0 mL培養液,待細胞長滿后進行下一步實驗。

1.3 實驗設計及樣品采集

本實驗設置對照組與實驗組,對照組加入抑制劑的溶劑,實驗組加入不同濃度抑制劑。抑制劑用DMSO稀釋至適宜濃度,當鱖腦原代細胞分離至第三代之后,即可進行實驗。將腦細胞擴大培養,鋪板至6 cm2平皿中,每個平皿盛放2.5 mL培養液,封口膜封口放入28℃無CO2恒溫培養箱中培養。大概4d細胞覆蓋率可達80%,使用無添加試劑的L15基礎培養基對原代細胞進行饑餓16—24h。抑制劑用DMSO稀釋至適宜濃度備用,吸除廢液后再用無添加試劑的L15基礎培養基進行清洗。吸取添加了抑制劑或緩沖液的L15基礎培養基刺激細胞(根據不同抑制劑的效用不同,添加的抑制劑量不同,本研究T-5224采用0、10、30和60 μmol/L處理濃度;KN-62采用200 nmol/L),封口膜封口,放入28℃無CO2恒溫培養箱中,根據不同抑制劑效用,決定抑制劑的刺激時間,本研究T-5224處理24h,KN-62處理2h。刺激時間到達后分別收集細胞中RNA和DNA進行后續實驗操作,樣品凍存于–80℃超低溫冰箱。

1.4 翹嘴鱖相關基因的 mRNA 表達水平分析

利用 TRIzol Reagent 試劑 (TaKaRa) 來提取翹嘴鱖腦原代細胞的總RNA,再用 HiScript II Q RT SuperMix for qPCR 逆轉錄試劑盒(諾唯贊)進行反轉錄得到cDNA。采用實時熒光定量 RT-PCR 方法測定腦細胞中c-fos和t1r1基因的mRNA表達水平。反應體系 (20 μL) 如下:SYBR Green Supermix 10 μL,F 0.4 μL,R 0.4 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 8.2 μL。反應程序如下:95℃,5min;95℃,10s;退火溫度30s和延伸30s,共39個循環。每經過一個循環,收集一次熒光強度信號,采用優化的2–ΔΔC t法,以rpl13a基因的定量表達水平為內參進行相對表達量分析,每個樣品重復6次。本試驗所用到的熒光定量引物均采用Primer 5.0軟件進行設計,并由生工合成,引物序列見表 1。

1.5 翹嘴鱖t1r1基因DNA甲基化水平分析和亞硫酸氫鹽硫化PCR (BSP)

將收集的DNA樣品采用TIANamp Genomic DNA Kit (Tiangen,Beijing,China) 試劑盒說明書的標準步驟提取基因組DNA。采用EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research,Irvine,CA,USA)試劑盒說明書的標準步驟進行基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾。原理如下:基因組DNA中甲基化胞嘧啶堿基不轉變,同時,未甲基化胞嘧啶脫氨基并轉變成尿嘧啶,經亞硫酸氫鹽硫化PCR (Bisulphite Sequencing Polymerase Chain Reaction,BSP)擴增后為胸腺嘧啶,從而區別甲基化/未甲基化的兩類胞嘧啶。從實驗室翹嘴鱖全基因組中獲得t1r1的全序列[27],基因5′側翼區的序列,第一外顯子區的序列,ATG上游3500 bp的序列,提交至在線預測網站Methprimer(http://www.urogene.org/cgibin/methprimer/methpri mer.cgi) 進行預測以獲得CpG島 (CGI) 和候選CpG位點。魚類CpG島無明確定義,選擇默認參數并根據情況進行調整,默認搜索參數如下:CpG島片段大小 (Island size) ＞ 100 bp,GC堿基含量(GC Percent) ＞ 50.0%,CpG島觀察值/預測值 (Observed/Expected,Obs/Exp) ＞ 0.6。BSP引物由在線軟件MethPrimer 14.0推薦,然后用Primer 5.0檢測是否合格,比較后采用特異性高引物用于BSP的擴增(表 1)。采用Taqplus DNA Polymerase (Vazyme Biotech,Nanjing,China) 在Biometra Thermo cyclers (Biometra,G?ttingen,Germany) 儀器上進行PCR。PCR反應循環參數為:94℃預變性5min;然后如下程序進行40個循環,即94℃變性30s,52℃(根據不同引物的退火溫度)退火30s,72℃延伸30s;之后72℃延伸7min,最終12℃降溫10s后結束。采用Gel Purification Kit (Sangon,Shanghai,China) 試劑盒純化PCR產物,然后克隆至載體pMD18-T clone vector(TaKaRa,Tokyo,Japan) 中。在每個實驗組中,先隨機選取2個樣品進行預擴增及分析,存在DNA甲基化后檢測全部6個樣品。每個樣品隨機選取5個陽性克隆送至上海生工 (ABI3730 測序儀,Applied Biosystems) 進行測序,每個馴食實驗組總共收集成功測序的30個陽性克隆,經測序得到DNA序列。采用在線網站QUMA (QUantification tool for Methylation Analysis) (http://quma.cdb.riken.jp/) 將測序序列與亞硫酸氫鹽修飾前原序列進行比對分析,根據比對結果確定候選CpG位點是否發生甲基化以及甲基化水平。

表1 實時熒光定量 PCR 的引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of the primers for real-time PCR

1.6 統計分析

采用軟件SPSS 22.0 (IBM,Chicago,IL,USA)的Shapiro-Wilk法標準化數據,進行單因素方差分析。檢查方差齊性之后,通過Duncan’s multiple range test (MRT) 法檢測均值間差異。實驗組組間候選CpG位點甲基化水平的差異使用2×2卡方檢驗(χ2test)分析,實驗組組間基因表達水平的差異使用獨立樣本T檢驗分析,P＜0.05判定顯著差異,P＜0.01判定為極顯著差異。所有數據表示為平均值±SEM(平均值的標準誤差)。

2 結果

2.1 T-5224刺激鱖腦細胞后學習記憶因子c-fos及味覺受體t1r1 mRNA表達水平變化

使用學習記憶因子c-fos的抑制劑T-5224處理鱖腦原代細胞,利用RT-PCR技術比較使用T-5224抑制劑處理鱖腦細胞24h后,對照組0和實驗組nμmol/Lc-fos和t1r1(n表示不同濃度)mRNA水平(圖 1)。不同的實驗條件刺激鱖腦原代細胞得到不同的結果,圖 1A中不同濃度的T-5224處理與對照組相比,c-fosmRNA的表達水平均顯著降低(P＜0.05),而10 μmol/L處理效果最明顯,30 μmol/L次之。與此同時在圖 1B中不同濃度的T-5224處理與對照組相,t1r1mRNA的表達水平均顯著降低(P＜0.05),而30和60 μmol/L處理效果最明顯。

圖1 不同濃度T-5224處理c-fos和t1r1基因表達水平檢測Fig.1 Detection of c-fos and t1r1 gene expression level treated with different concentrations of T-5224

2.2 KN-62刺激鱖腦細胞后學習記憶因子c-fos及味覺受體t1r1 mRNA表達水平變化

使用學習記憶通路CAMKII抑制劑KN-62處理鱖腦原代細胞,參考彭建等[23]的選定最佳時間點和藥物濃度,我們選定2h這個時間進行對照組0和實驗組200 nmol/L濃度抑制劑刺激實驗(圖 2),在200 nmol/L-2h的刺激條件下,c-fosmRNA表達水平呈現極顯著上升趨勢 (P＜0.01),與此同時在相同處理條件下t1r1mRNA表達水平也呈現極顯著上升趨勢(P＜0.01)。

圖2 KN-62處理后c-fos和t1r1基因表達水平檢測Fig.2 Detection of c-fos and t1r1 gene expression level after KN-62 treatment

2.3 T-5224和KN-62刺激鱖腦細胞后味覺受體t1r1基因DNA甲基化水平的變化

我們分析了t1r1起始密碼子(指定為1)至上游–3500 bp處的CpG島。在翹嘴鱖t1r1基因的這一區域中存在一個CpG島,CpG 島全長為 177 bp。從t1r1基因結構圖中看到預測 CpG 島中 9 個候選CpG 位點的分布情況,它們分別位于–3085、–3071、–3062、–3049、–3041、–2988、–2981、–2973 和–2965 bp (圖 3)。通過前期抑制劑濃度和處理時間的最適篩選,抑制劑T-5224 30 μmol/L和KN-62 200 μmol/L處理發現,T-5224處理組與對照組各CpG位點發生甲基化甲基化的概率很高,但都無顯著性差異,而KN-62處理組與對照組各CpG位點發生甲基化甲基化的概率也很高,但是也都無顯著差異(表 2;圖 4)。

圖4 翹嘴鱖不同濃度抑制劑處理后t1r1基因各個CpG位點DNA甲基化水平Fig.4 DNA methylation level of each CpG site of t1r1 gene treated with different concentrations of inhibitors in Siniperca chuatsi

表2 不同處理后t1r1的5′-側翼區域中CpG島中每個CpG位點的甲基化概率Tab.2 Methylation status of each CpG (cytosine-guanine) site in the CpG island in the 5′-flanking regions of t1r1 (taste 1 receptor member 1) after different treatment

圖3 翹嘴鱖t1r1基因CpG島分布及CpG位點信息Fig.3 The distribution and locations of CpG islands of t1r1 gene

3 討論

3.1 學習記憶因子c-fos對翹嘴鱖味覺受體t1r1基因調控表達分析

本研究結果表明抑制劑T-5224在10—30 μmol/L對抑制c-fos的轉錄水平效果最佳,與此同時t1r1的轉錄水平也受到了抑制效果。而抑制劑KN-62的結果相反,KN-62處理后c-fos及t1r1的表達水平都顯著升高。T-5224作為特異性抑制c-Fos/c-Jun的DNA結合活性而不影響包括NF-κB在內的其他轉錄因子的結合活性的抑制劑[28,29],其可以抑制cfos基因mRNA的轉錄表達[30]。同時KN-62作為CaMKII的特異性激酶,可以使得CaMKII不能發生磷酸化而處于無活性狀態[31],同時研究報道由CaMKII引起磷酸化后的CREB能引發基因表達[32],而磷酸化后被激活的CREB參與c-fos基因的轉錄[33],我們結果與此一致。有研究報道,c-fos的表達是小鼠海馬區依賴性非空間記憶的形成和反復記憶所必需的[15],而學習記憶可以影響魚類攝食及食性的過程[34]。我們之前的研究表明,c-fos可能是影響魚類馴食的關鍵基因[23]。而味覺受體t1r1就是馴食基因之一,它不僅是鮮味感覺受體,在動物鮮活餌料識別過程中發揮關鍵作用,還在最近的研究中被發現可結合神經遞質在腦中海馬區表達,與學習記憶相關[35—38]。竇亞琪等[25]通過翹嘴鱖活體研究表明c-fos的變化可能影響味覺受體t1r1的mRNA的轉錄水平,從而影響鱖魚馴化后接受人工飼料。本研究首次在翹嘴鱖腦細胞證實了抑制劑T-5224對cfos的負調控和KN-62對c-fos的正調控,同時表明cfos作為一個轉錄因子很可能調控了翹嘴鱖味覺受體基因t1r1,從而影響其攝食偏好。

3.2 學習記憶因子c-fos對翹嘴鱖味覺受體t1r1基因DNA甲基化水平分析

DNA甲基化可能參與到精確調節基因表達使物種適應環境[38]。DNA甲基化調控機制已在多個領域中進行研究,包括生態毒理學,性發育和遺傳育種[40—42],然而在攝食性狀與記憶形成之間聯系的方面尚沒有任何研究[43]。大熊貓t1r1的假基因化與大熊貓從肉食性向草食性的轉化密切相關[17,18],進一步有研究發現,在不同程度馴食翹嘴鱖研究中發現,鱖腦中c-fos轉錄水平變化的同時,t1r1基因調控區的DNA甲基化水平也發生變化,從而造成t1r1基因的轉錄水平變化。T1r1的DNA甲基化對鱖攝食死餌料魚的記憶再鞏固和穩定至關重要,因此cfos可能通過t1r1基因DNA甲基化參與調控t1r1轉錄水平[25]。本研究結果中t1r1基因在兩種抑制劑的處理下其各位點及總體甲基化的概率都較高,但是基本無差異。與竇亞琪等[25]的結果不一致,這種差異可能是由于體外實驗與體內實驗的潛在差異造成的。在細胞水平上,鱖腦細胞中c-fos可能通過未知其他途徑調控t1r1的轉錄水平。

4 結論

綜上所述,本研究我們比較了兩種抑制劑T-5224和KN-62對翹嘴鱖腦味覺受體t1r1基因mRNA表達及DNA甲基化的影響,結果表明c-fos可能影響味覺受體t1r1的轉錄水平,但不通過t1r1基因DNA甲基化影響其轉錄水平。同時我們首次在魚類上證實T-5224對c-fos的負調控及KN-62對c-fos的正調控作用。為進一步了解學習記憶促進魚類新食性形成的作用機制,并通過有效提高鱖魚學習記憶能力來解決鱖魚飼料養殖過程中難馴化及馴化不穩定問題提供了理論依據。