人工生產(chǎn)僵蠶菌種質(zhì)量檢驗(yàn)

孫 佩，葉 霄，童 文，龍燕梅，況再銀

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，成都 610300）

0 引言

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4～5 齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥體[1]。具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)功效，用于肝風(fēng)夾痰、驚癇抽搐、小兒急驚等。僵蠶的傳統(tǒng)主要來源是收集家蠶飼養(yǎng)過程中自然僵死的病蠶，由于養(yǎng)蠶技術(shù)的發(fā)展，自然僵蠶越來越少，產(chǎn)量和質(zhì)量不穩(wěn)定[2]，亟需開展人工生產(chǎn)僵蠶，保障僵蠶的藥用需求。人工生產(chǎn)僵蠶需要把僵蠶菌種（即球孢白僵菌分生孢子）配制成一定濃度的懸浮液均勻噴在5 齡蠶體上，之后按常規(guī)方法飼養(yǎng)家蠶，并保持一定的溫度、濕度，使分生孢子萌發(fā)侵入蠶體，導(dǎo)致家蠶在結(jié)繭前僵死，干燥后形成僵蠶藥材[3]。

20世紀(jì)50年代末期，由中國藥材公司投資在海南島文昌縣建立了全國第一間僵蠶廠[4]。江蘇馬山公社從1968 年開始人工培養(yǎng)白僵蠶[5]，試驗(yàn)了僵蠶的產(chǎn)量與白僵菌的分生孢子的毒力、數(shù)量和家蠶成僵率之間的關(guān)系。同時(shí)期，廣東省藥材部門在太湖馬山公社和增城縣石灘公社建立了僵蠶場(chǎng)[4]。此后，河南濟(jì)源、甘肅蘭州、福建晉江等地也先后建立僵蠶廠（場(chǎng)）進(jìn)行人工培養(yǎng)白僵蠶。1982 年，王印安[6]報(bào)道了河南濟(jì)源中藥材試驗(yàn)場(chǎng)直接用鮮僵蠶制成孢子懸浮液進(jìn)行噴霧接種生產(chǎn)僵蠶，接種量的大小根據(jù)家蠶對(duì)白僵菌抵抗力的強(qiáng)弱，菌株毒力的大小等情況靈活地掌握。這些養(yǎng)殖基地的白僵菌種的來源有2個(gè)途徑。一是直接用新鮮僵蠶洗水，取其孢子液進(jìn)行噴射蠶體接種（江蘇的經(jīng)驗(yàn)）；二是進(jìn)行人工培養(yǎng)，從新鮮僵蠶體上分離球孢白僵菌，進(jìn)行純培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)，選擇取材方便、經(jīng)濟(jì)且適合白僵菌繁殖的培養(yǎng)基[4]。時(shí)至今日，人工僵蠶基地的蠶農(nóng)依然采用自然僵蠶體表的白僵菌孢子進(jìn)行僵蠶生產(chǎn)接種。蠶農(nóng)自繁自留的自然僵蠶菌種未經(jīng)過純化和篩選，缺乏可參考的質(zhì)量指標(biāo)，使用多憑經(jīng)驗(yàn)，導(dǎo)致人工僵蠶產(chǎn)量低，僵化差。

為了滿足人工僵蠶生產(chǎn)需求，王更先[7]在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)9株白僵菌，15天后獲取大量分生孢子，確定人工生產(chǎn)白僵蠶白僵菌的接種濃度應(yīng)在1×107個(gè)/mL孢子以上。楊瓊等[8]報(bào)道了僵蠶菌種篩選、最佳接種劑量、適宜蠶品種的研究，確定了最佳菌株、最佳接種濃度和適宜的蠶品種。邢東旭等[9]分離純化到一株高致病力的白僵菌，并對(duì)接種該菌株生產(chǎn)僵蠶的藥用品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。李文學(xué)等[10]從自然感病僵蠶上分離的致病菌株進(jìn)行鑒定，并研究其人工飼養(yǎng)僵蠶的最適使用濃度。陳靜等[11]用一株家蠶病原白僵菌在PDSA培養(yǎng)基生長和產(chǎn)孢，進(jìn)行2 次中試人工生產(chǎn)白僵蠶。前人的研究使用的白僵菌種處于實(shí)驗(yàn)室平板培養(yǎng)階段，未開展菌種（孢子粉）規(guī)模化擴(kuò)繁和生產(chǎn)應(yīng)用，未見僵蠶菌種質(zhì)量檢驗(yàn)方法或檢驗(yàn)指標(biāo)的報(bào)道。蠶農(nóng)對(duì)優(yōu)質(zhì)僵蠶菌種有需求，而市場(chǎng)上流通的菌種（自然僵蠶孢子粉）缺少檢驗(yàn)方法和質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，質(zhì)量難以分辨。對(duì)于僵蠶人工生產(chǎn)，亟需質(zhì)量穩(wěn)定的僵蠶菌種和菌種質(zhì)量檢驗(yàn)方法，以保障人工接種生產(chǎn)僵蠶成功。

球孢白僵菌有3種形式的侵染體，即分生孢子、芽生孢子和菌絲。徐慶豐[12]等發(fā)現(xiàn)，白僵菌的氣生分生孢子要比液生分生孢子耐貯，殺蟲試驗(yàn)中液生分生孢子與固體分生孢子的效果相近或稍低，芽生孢子則毒力很低。駱家玉[13]采用玉米面、麥麩、水作培養(yǎng)液，麩皮、谷殼、大米作固體培養(yǎng)基開展了球孢白僵菌液固雙相發(fā)酵的研究。張麗靖[14]以去掉瓊脂的薩氏培養(yǎng)液作培養(yǎng)液，以低價(jià)質(zhì)差釉稻米作固體培養(yǎng)基開展了球孢白僵菌液固雙相發(fā)酵的研究。樊美珍等[15]經(jīng)過比較，營養(yǎng)貧乏的PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)白僵菌容易產(chǎn)生變異，SDAY 培養(yǎng)白僵菌最穩(wěn)定，且最適合白僵菌生長。本課題組前期篩選了優(yōu)質(zhì)球孢白僵菌株，并采用液固雙相發(fā)酵法培養(yǎng)了高純度的孢子粉。參考GB/T25864—2010《球孢白僵菌粉劑》[16]、NY/T2295.1—2012《真菌微生物農(nóng)藥球孢白僵菌第1部分：球孢白僵菌母藥》[17]、SN/T 2374—2009《綠僵菌、白僵菌生物農(nóng)藥檢驗(yàn)操作規(guī)程》[18]等標(biāo)準(zhǔn)中的菌種鑒別、含孢量、雜菌率等檢驗(yàn)方法并加以改進(jìn)，開展液固雙相發(fā)酵法制備的僵蠶菌種和自然僵蠶菌種的質(zhì)量檢驗(yàn)，建立可靠的僵蠶菌種檢驗(yàn)方法和質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)人工僵蠶生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 儀器及設(shè)備

Nikon80i 熒光顯微鏡、丹佛T-203 千分之一分析天平，攪拌器，血球計(jì)數(shù)板(25×16)，玻璃器皿等。

1.2 僵蠶菌種來源

本課題組前期從自然僵蠶中分離并篩選出1株優(yōu)質(zhì)球孢白僵菌株BJ-MJ，經(jīng)18S rDNA/ITS序列分子鑒定，該菌與球孢白僵菌同源性均在99%，并結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定為球孢白僵菌。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]，改為用菌袋包裝固體培養(yǎng)基（專利申請(qǐng)?zhí)枺?01910703859.1）進(jìn)行液固雙相發(fā)酵法培養(yǎng)BJ-MJ 菌株孢子粉。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)3批BJ-MJ菌孢子粉作為對(duì)照菌種，從云南和廣西的人工僵蠶基地收集2 批自然僵蠶菌種，從網(wǎng)絡(luò)購買1批僵蠶菌種，見表1。

表1 僵蠶菌種信息

1.3 僵蠶菌種檢驗(yàn)方法

1.3.1 顯微計(jì)數(shù)法測(cè)活孢數(shù)

（1）方法提要：標(biāo)準(zhǔn)GB/T25864—2010“孢子萌發(fā)率”和標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2374—2009 中“活孢率”的測(cè)定是指萌發(fā)的孢子數(shù)占孢子總數(shù)的百分比。由于球孢白僵菌孢子很小（直徑2～3 μm），受菌種制備條件影響，在顯微鏡下難以分辨孢子和其他雜質(zhì)（培養(yǎng)料顆粒或蠶砂渣），孢子總數(shù)計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確會(huì)影響活孢率的計(jì)算結(jié)果。而萌發(fā)后的孢子在顯微鏡下形態(tài)清晰，進(jìn)行萌發(fā)的孢子計(jì)數(shù)可操作性好且準(zhǔn)確。本試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T25864—2010“孢子萌發(fā)率”測(cè)定方法，將孢子粉用麥芽浸粉培養(yǎng)液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，經(jīng)過搖床培養(yǎng)萌發(fā)后，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)萌發(fā)孢子數(shù)作為活孢數(shù)。

（2）顯微計(jì)數(shù)法測(cè)活孢數(shù)檢驗(yàn)程序：用精度為千分之一的天平準(zhǔn)確稱取孢子粉1.00 g，裝入盛有滅菌麥芽浸粉培養(yǎng)液（含2%麥芽浸粉和0.05%吐溫80，用蒸餾水配制，在121℃條件下滅菌20 min）100 mL的三角瓶中，搖動(dòng)三角瓶使孢子粉潤濕后，用手持電動(dòng)攪拌器攪拌1 min，即成為均勻的孢子母液。用無菌移液管吸取5.0 mL 上述母液，加至盛有滅菌麥芽浸粉培養(yǎng)液45 mL 的三角瓶中，按1→10 進(jìn)行系列稀釋（參照表2），分別得到不同稀釋度孢子懸液（每個(gè)稀釋度應(yīng)更換無菌移液管）。

將0～4 號(hào)孢子懸液置于120 r/min 的搖床上，在26℃條件下培養(yǎng)16 h，取樣制片鏡檢。選擇孢子濃度在每中格20～40 個(gè)的稀釋度用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，芽管大于孢子半徑的萌發(fā)孢子計(jì)為活孢子。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)格為25 個(gè)中格，16 個(gè)小格，則計(jì)算雙線范圍內(nèi)4 個(gè)中格共64 個(gè)小格的孢子總數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)每中格的四周如有壓線的孢子，計(jì)上線不計(jì)下線，計(jì)左線不計(jì)右線。按公式(1)計(jì)算待測(cè)樣品的活孢子含量：

式中：S—活孢數(shù)，孢子/g；S1～S4—任意4個(gè)中格中萌發(fā)孢子的數(shù)量；T—為稀釋倍數(shù)。

1.3.2 菌種鑒別 采用1.3.1 項(xiàng)下稀釋涂布法將僵蠶菌種在1.3.3項(xiàng)下平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)出菌落后，觀察菌落形態(tài)學(xué)特征，在顯微鏡下根據(jù)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)進(jìn)行鑒別。球孢白僵菌形態(tài)特征為菌落絨狀，叢卷毛狀至粉狀，有時(shí)呈繩束狀，但很少形成束絲梗；白色，稍后或變成淡黃色，偶成淡紅色；背面無色，或淡黃至粉紅色。分生孢子梗多，著生在營養(yǎng)菌絲上，粗1～2 μm。產(chǎn)孢細(xì)胞（瓶梗）濃密簇生于菌絲、分生孢子梗或膨大的泡囊（柄細(xì)胞）上，球形至瓶形，頸部明顯延長成粗1 μm、長達(dá)20 μm的產(chǎn)孢軸，軸上具小齒突，呈膝狀彎曲（“之”字形彎曲）產(chǎn)孢細(xì)胞和泡囊常增生，在分生孢子梗或菌絲上聚成球形至卵形的相當(dāng)密實(shí)的孢子頭。分生孢子球形或近球形，透明，光滑，(2～3)×(2～2.5)μm[19]。

1.3.3 細(xì)菌、真菌雜菌、球孢白僵菌的平板菌落計(jì)數(shù)

（1）方法提要：參考NY/T 2295.1—2012，“雜菌率的測(cè)定”用營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基檢測(cè)樣品中的細(xì)菌雜菌。參考GB 20287—2006[20]“霉菌雜菌數(shù)的測(cè)定”用馬丁培養(yǎng)基檢測(cè)樣品中的真菌雜菌，按照GB 20287—2006“有效活菌數(shù)的測(cè)定”進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。將樣品配制成不同梯度的孢子懸浮液，分別涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和馬丁培養(yǎng)基平板上，利用細(xì)菌生長快于真菌的特點(diǎn)，在24～48 h 時(shí)，對(duì)適宜濃度的NA 平板上長出的細(xì)菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)；在72～96 h時(shí)，對(duì)適宜濃度的馬丁平板上長出球孢白僵菌和真菌雜菌分別計(jì)數(shù)。根據(jù)代表性菌落的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，參照1.3.2項(xiàng)下方法進(jìn)行白僵菌鑒定。

（2）平板菌落計(jì)數(shù)檢驗(yàn)程序：用精度為千分之一的天平準(zhǔn)確稱取孢子粉1.00 g，裝入盛有含0.05%吐溫80 的滅菌水100 mL 的三角瓶中，用手持電動(dòng)攪拌器攪拌1 min，即成為均勻的孢子母懸液。參照表2進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液為含0.05%吐溫80 的滅菌水，得到不同稀釋度孢子懸液。

表2 梯度稀釋示例

每個(gè)樣品取3 個(gè)連續(xù)適宜的稀釋度，用微量移液器吸取不同稀釋度孢子懸液0.1 mL，分別加至預(yù)先制備好的營養(yǎng)瓊脂和馬丁培養(yǎng)基平板上，用曲玻棒涂布均勻，每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)以含0.05%吐溫80的滅菌水作空白對(duì)照，在26℃條件下培養(yǎng)。

根據(jù)菌落特征，營養(yǎng)瓊脂平板在培養(yǎng)24～48 h 時(shí)進(jìn)行細(xì)菌雜菌計(jì)數(shù)，馬丁培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)72～96 h時(shí)進(jìn)行真菌雜菌和球孢白僵菌分別計(jì)數(shù)，以出現(xiàn)20～300個(gè)菌落數(shù)的稀釋度的平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在20～300 個(gè)之間時(shí)，則以該平均菌落數(shù)計(jì)算。若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在20～300個(gè)之間時(shí)，應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值決定。若其比值≤2應(yīng)計(jì)算兩者的平均數(shù)；若＞2則以稀釋度小的菌落平均數(shù)計(jì)算。

式中：N-每克樣品中的菌落數(shù)(CFU/g)；S1～S3—符合計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的稀釋度的3 個(gè)平板菌落數(shù)；T—為稀釋倍數(shù)；M—樣品量，單位為克。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微計(jì)數(shù)萌發(fā)孢子檢驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過16 h培養(yǎng)，1號(hào)孢子懸液適合鏡檢計(jì)數(shù)，見圖1。由圖1可知，BJ-MJ-1孢子萌發(fā)數(shù)量多，且孢子兩端萌發(fā)菌絲長，無其他雜菌菌體。WG 萌發(fā)孢子數(shù)量少且菌絲短（活力差）。YN 和GX 萌發(fā)孢子數(shù)量少且菌絲短，其他雜菌（桿狀細(xì)菌等）多，背景渾濁。顯微計(jì)數(shù)法測(cè)活孢數(shù)結(jié)果見表3，3批采用液固雙相發(fā)酵培養(yǎng)的孢子粉，萌發(fā)孢子數(shù)最高（＞3.3×1010孢子/g），自然僵蠶孢子萌發(fā)數(shù)較低（3.7×109～1.4×1010孢子/g）。

圖1 顯微鏡下示孢子萌發(fā)

2.2 菌種鑒別與平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2.1 菌種鑒別 在馬丁培養(yǎng)基上，球孢白僵菌落經(jīng)過96 h 培養(yǎng)呈絨毛狀，144 h 后產(chǎn)孢后菌落呈粉狀，見圖2。選擇各樣品中稀釋度適宜，雜菌稀少的平板，挑起典型的白色菌落，觀察產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子形態(tài)，均符合“1.3.2”描述，經(jīng)形態(tài)鑒別判定為球孢白僵菌。

圖2 BJ-MJ-1在馬丁培養(yǎng)基形態(tài)

2.2.2 平板活孢和真菌雜菌計(jì)數(shù) 經(jīng)過96 h培養(yǎng)，選擇適宜稀釋度的馬丁平板進(jìn)行真菌雜菌計(jì)數(shù)，選擇稀釋度5～6 號(hào)的馬丁平板進(jìn)行活孢（白僵菌落）計(jì)數(shù)，結(jié)果見表3。由圖可知，經(jīng)液固雙相發(fā)酵培養(yǎng)BJ-MJ-1全部為白色白僵菌菌落（無其他真菌雜菌），WG 中黑色和白色真菌雜菌數(shù)量多，YN 中有綠色霉菌，GX 中有白色真菌雜菌。除“BJ-MJ-3”的1 號(hào)稀釋度平板長出雜菌外，其他液固雙相發(fā)酵孢子粉樣品在1號(hào)稀釋度平板均未檢出真菌雜菌，真菌雜菌數(shù)表示為＜104CFU/g。

2.2.3 細(xì)菌平板計(jì)數(shù) 經(jīng)過48 h培養(yǎng)，選擇適宜的營養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果見表3。圖5 為3 號(hào)稀釋度的平板培養(yǎng)96 h 白僵菌落長出時(shí)拍攝。由圖3 可知，經(jīng)液固雙相發(fā)酵培養(yǎng)的BJ-MJ-1 全部為白色白僵菌菌落（無細(xì)菌），WG、YN、GX 中細(xì)菌數(shù)量多，長滿平板。液固雙相發(fā)酵孢子粉3批樣品在1號(hào)稀釋度平板均未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌雜菌，細(xì)菌雜菌數(shù)表示為＜104CFU/g。

圖3 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)

表3 僵蠶菌種活孢數(shù)和雜菌檢驗(yàn)結(jié)果

圖5 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基示細(xì)菌雜菌

圖4 馬丁培養(yǎng)基示真菌雜菌

3 結(jié)論與討論

目前生產(chǎn)中使用的自然僵蠶篩分獲得的蠶體孢子粉，蠶農(nóng)憑經(jīng)驗(yàn)用量為15～35 g，由于含孢量低并且用量不準(zhǔn)確，導(dǎo)致蠶僵死率低。此外，自然僵蠶在開放的環(huán)境僵化和產(chǎn)孢，常遭環(huán)境中其他微生物污染，蠶體還可攜帶上一批養(yǎng)殖的細(xì)菌類蠶病，接種家蠶后產(chǎn)生膿蠶，造成養(yǎng)殖損失。且不同季節(jié)僵蠶僵化的環(huán)境條件變化，蠶體孢子質(zhì)量極不穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果表明，3批采用液固雙相發(fā)酵培養(yǎng)的孢子粉，萌發(fā)孢子數(shù)＞3.3×1010孢子/g，平板活孢數(shù)＞1010CFU/g，真菌雜菌數(shù)＜104CFU/g，細(xì)菌雜菌數(shù)＜104CFU/g。自然僵蠶孢子萌發(fā)數(shù)較低（3.7×109～5.9×109孢子/g），平板活孢數(shù)較低(1.5×109～1.8×1010)，真菌雜菌＞105CFU/g，細(xì)菌數(shù)量＞108CFU/g。為了保證人工僵蠶接種成功，建議僵蠶人工養(yǎng)殖采用液固雙相發(fā)酵法制備的球孢白僵菌孢子粉，規(guī)定液固雙相發(fā)酵法制備的僵蠶菌種（孢子粉）質(zhì)量指標(biāo)活孢數(shù)（顯微計(jì)數(shù)萌發(fā)孢子或平板活孢數(shù)）≥1010孢子/g，真菌雜菌數(shù)的含量＜105CFU/g，細(xì)菌雜菌數(shù)的含量＜105CFU/g。

筆者參考文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行了生產(chǎn)試驗(yàn)，接種家蠶需要的孢子懸浮液濃度為107孢子/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但文獻(xiàn)均未報(bào)道孢子粉具體用量。本課題組采用液固雙相發(fā)酵法培養(yǎng)的孢子粉，含量高于1010孢子/g，萌發(fā)好，經(jīng)過不同季節(jié)、不同蠶種生產(chǎn)試驗(yàn)，確定每張蠶種（約3 萬頭）養(yǎng)至5 齡起蠶接種孢子粉用量只需1.5～2.0 g，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。

由于人工僵蠶基地的菌種通常來源于自然僵蠶，采用形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行菌種鑒定快速且容易操作，通常情況下已夠用。但形態(tài)特征常會(huì)因營養(yǎng)條件和寄主的不同而發(fā)生變異[21]，分子標(biāo)記技術(shù)在白僵菌鑒定研究中應(yīng)用普遍[22]，在有爭(zhēng)議的情況下，可參考SN/T 2374—2009中附錄B，采用18S rDNA/ITS序列進(jìn)行白僵菌分子鑒定。

在高溫和高濕的條件下孢子粉極易失活，故孢子粉一般采用低溫低濕避光保存，常溫貯存不超過半年[16]。由于家蠶養(yǎng)殖具有穩(wěn)定的季節(jié)性，建議孢子粉培養(yǎng)根據(jù)僵蠶生產(chǎn)計(jì)劃臨用前制備，克服孢子粉不耐儲(chǔ)存的缺陷。由于孢子粉具有疏水性，直接加入水中會(huì)漂浮表面，僵蠶生產(chǎn)接種用孢子懸浮液需攪拌機(jī)攪勻或者裝入瓶中振搖混懸，需進(jìn)一步開展孢子粉可濕性粉劑的配方研究，為人工僵蠶生產(chǎn)提供使用方便、質(zhì)量好的菌種。