蛋白酪氨酸磷酸酶4A3(PTP4A3)促進小鼠胎肝來源紅系細胞脫核

胡欣俊，余東林，范 宏，韓改凈，薛 征，呂 湘

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 病理生理學系 醫學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

輸血治療仍是目前臨床上不可替代的治療手段且用血量日益增長。已有在體外液體培養基中，由造血干細胞或胚胎干細胞誘導分化形成成熟紅細胞的技術，但其中干細胞體外分化效率低，分化細胞成熟度不夠，紅系終末分化和脫核效率低等問題都是困擾體外高效造血的限速步驟。

蛋白酪氨酸磷酸酶4A3(protein tyrosine phos-phatase type 4A member3,Ptp4a3)基因位于8號染色體長臂(8q24.3)，由40 462個堿基對組成。PTP4A3蛋白共 173個氨基酸，分子質量19 535 ku，屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員。PTP4A3促進小鼠胎肝來源紅系細胞脫核在細胞增殖[1]、腫瘤發生和轉移[2]及自噬等過程中均發揮重要作用。有報道PTP4A3促進小鼠胎肝來源紅系細胞脫核可通過促進有絲分裂G1期向S期轉換參與腫瘤發生發展[3]。PTP4A3促進小鼠胎肝來源紅系細胞脫核在小鼠紅系終末分化細胞中高表達，但其功能尚未明確。本工作初步探討并提示PTP4A3促進小鼠胎肝來源紅系細胞脫核在紅系脫核中發揮重要調控功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞： C57 孕鼠取E 13.5 胎肝，磁珠分選Ter119陰性細胞；人胚腎上皮細胞系HEK-293T(ATCC細胞庫https://www.atcc.org)。

1.1.2 試劑：胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、細胞培養基IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、L-谷氨酰胺(L-glutamine)、血清替代物、PFHM-Ⅱ(Gibco公司) ；β-巰基乙醇、地塞米松、膽固醇、轉鐵蛋白(holo-transferrin)、MTG、HEPES(Sigma-Aldrich公司)；重組人胰島素(翎圣公司)；IL-3、EPO(Peprotech公司)；IGF-1、SCF(Stem Cell公司)；線性 PEI轉染試劑p4000(北京蘭博利德生物科技公司)。青霉素-鏈霉素抗生素、F108(Invitrogen公司)；Ter119磁珠(BD公司)；構建質粒所需的內切酶(NEB公司)；SYBR Green PCR試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 質粒的構建：構建shRNA干擾質粒，在Splashrna網站(http://splashrna.mskcc.org)設計shRNA，使用sh-Luc(Ctrl)作為對照組,sh-PTP4A3作為實驗組。合成相應干擾序列并在兩端加入KpnⅠ/XhoⅠ 酶切位點，95 ℃ 高溫退火，得到的雙鏈片段與線性化的 SFFV-GFP-mir30 載體連接，轉化后挑菌提質粒，進行病毒包裝。

1.2.2 病毒包裝體系：A液，20 μL P4000 +500 μL 0.9%氯化鈉溶液3；B液，PAX2 7.5 μg，pMD2.G 3.5 μg，干擾質粒10 μg。A液配制完成后室溫靜置5 min，再與B液混合，二者混勻室溫靜置15 min后加于HEK-293T細胞中。

1.2.3 小鼠胎肝培養體系：胎肝細胞復蘇后前3 d使用增殖培養基，第4天更換分化培養基直至第7天。細胞濃度保持在約 2×106細胞/mL。

1.2.4 病毒包裝:48 h后收集病毒上清于50 mL離心管中，4 ℃ 3 000×g，離心15 min去除細胞碎片，0.45 μm濾膜過濾。病毒上清于無菌離心管中，超高速離心機，4 ℃ 50 000×g，離心4 h。病毒沉淀用DMEM培養基重懸(與病毒上清體積比為1∶100)。按細胞數加入病毒重懸液及HEPES和F108感染胎肝細胞，細胞置于恒溫37 ℃，5% CO2培養箱中培養，細胞為2 × 105個/mL。

1.2.5 流式細胞測量術檢測：細胞離心棄上清，BSA封閉30 min后，加入標記抗鼠Ter119-PE抗體避光孵育60 min，PBS洗滌，加入hoechst避光孵育10 min。使用SONY MA900全自動流式分選儀測, 并用FlowJo V10軟件分析結果。

1.2.6 RT-qPCR：收取細胞后利用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。使用SYBR Green進行實時熒光定量，檢測目標基因在mRNA水平的表達情況。

1.2.8 生物信息學分析：對分選得到的小鼠胎肝細胞進行轉錄組測序建庫并二代測序，測序文件(fastq格式)使用cutadapt和trimmomatic軟件去除接頭和低質量序列，數據清洗后使用hisat2軟件比對到小鼠基因組mm10得到sam文件，使用samtools壓縮為bam文件后，使用featureCounts軟件得到基因表達矩陣(count文件)。進一步使用deseq2包進行差異表達分析，使用pheatmap軟件可視化差異表達基因。

1.2.9 引物序列：短發夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)干擾序列及RT-qPCR引物序列見表1，2。

表1 shRNA干擾序列Table 1 Sequences for shRNA

表2 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

2 結果

2.1 篩選紅系終末分化的潛在調節基因

根據小鼠紅系終末分化4個時期的轉錄組測序數據，分析在此過程中平均表達水平在前100位且表達逐漸升高的基因。發現蛋白酪氨酸磷酸酶PTP4A4在早幼紅(basophilic erythroblast, Baso)、中幼紅(polychromatic erythroblast, Poly)和晚幼紅(orthochromatic erythroblast, Ortho)細胞中均有表達，且表達量逐步升高(圖1A)。PTP4A4是為數不多的在紅系分化晚期高表達的磷酸酶之一(圖1B)。在小鼠胎肝體外紅系分化體系中檢測Ptp4a3的表達，也證實PTP4A4隨紅系分化表達逐漸升高(圖1C)。

2.2 敲低Ptp4a3抑制紅系脫核

與對照細胞相比，兩條shRNA干擾序列均導致小鼠胎肝細胞中Ptp4a3mRNA表達水平顯著降低(圖2A)。與對照組相比，敲低Ptp4a3的表達導致胎肝來源紅系細胞中Ter119+Hoechst-無核紅細胞比例，即紅系脫核率，顯著降低(圖2B)(Ctrl: 25.3%±1.9%vssh-Ptp4a3-1: 14.4%±2.5%vssh-Ptp4a3-2: 16.9%±1.4%,n=3)，而沒有檢測到對紅系分化的明顯影響(圖2C)。

2.3 敲低Ptp4a影響細胞周期相關基因表達

在小鼠胎肝細胞中敲低Ptp4a3并誘導其向紅系分化，分選得到Ptp4a3敲低組與對照組有核紅細胞(Ter119+Hoechst+)進行轉錄組測序，主成分分析PCA(圖3A，左)和樣本聚類分析(圖3A，右)顯示樣本組內重復較好且組間具有明顯的差異。進一步進行差異表達分析，共獲得4 430個表達變化2倍以上的差異基因，其中上調基因1 718個，下調基因2 712個(圖3B，C)。下調差異基因中包括Ptp4a3，表明其敲低成功。對差異表達基因進行KEGG富集分析(圖3D)， 結果顯示敲低Ptp4a3后表達上調的基因富集細胞周期、PI3K-AKT信號通路、肌動蛋白細胞骨架相關通路，下調基因中未富集到已知與紅系脫核相關的調控通路。

A.genes with top100 ranked and a gradually increased expression during mouse terminal erythroid differentiation were displayed by heat map;B.heat map of phosphatases expression during mouse terminal erythroid differentiation;C.RT-qPCR indicated the gradually increased Ptp4a3 expression during in vitro erythroid differentiation of mouse fetal liver

A.RT-qPCR indicated that Ptp4a3 was successfully knocked down in mouse fetal liver-derived erythroid cells, *P<0.001 compared with sh-LUC; B.flow cytometry analysis showed that knockdown of Ptp4a3 expression resulted in significant decrease in the ratio of erythroid enucleation,*P<0.05 compared with sh-LUC; C.knockdown Ptp4a3 did not affect erythroid differentiation

A.PCA plot and sample distance matrix plot;B.volcano plot of differential expression genes from Ptp4a3 knockdown fetal liver-derived erythroid cells compared to Ctrl cells;C.heatmap of all differentially expressed genes, the color indicated the scaled expression level;D.KEGG enrichment analysis of upregulated genes

3 討論

本研究首先利用實驗室前期工作中小鼠紅系終末分化4個時期細胞轉錄組測序數據，篩選在紅系終末分化中可能發揮功能的基因。分析結果顯示在紅系分化晚期高表達的基因包括HBb、Alas2、Rbm38和Ptp4a3等。其中β-珠蛋白作為血紅蛋白亞基，在紅系終末分化晚期大量積累是紅系分化晚期特征基因[4]，Alas2是成紅細胞中負責血紅素合成的關鍵基因，其突變與 X 連鎖鐵粒幼細胞性貧血有關[5]，此外Rbm38是紅系生成中可變剪接的關鍵調節因子[6-7]。本工作聚焦研究同樣在紅系終末分化晚期高表達的PTP4A3在紅系終末分化及脫核中的功能。通過慢病毒感染敲低Ptp4a3會導致小鼠胎肝細胞來源紅系細胞脫核率顯著降低。RNA表達譜分析提示，Ptp4a3可能通過影響細胞周期相關基因或PI3K-AKT通路參與調節紅系細胞脫核。已有研究發現PI3K-AKT 通路在紅系細胞脫核過程中通過重新定位細胞核促進細胞極化及脫核[8]。

紅系分化與成熟對生命體至關重要，已有研究表明細胞骨架重塑、細胞周期調控及細胞分裂[9]、組蛋白釋放[10]等生物學過程與脫核密切相關。但蛋白磷酸酶在紅系脫核中的功能尚不清楚。 PTP4A3屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，包含一個酪氨酸磷酸化結構域，并具有雙重磷酸酶活性，可對蛋白質酪氨酸、蘇氨酸及絲氨酸位點去磷酸化，實現促進細胞增殖、血管生成和促進有絲分裂過程中G1期向S期的轉換等功能。研究表明細胞周期改變在紅系分化多個階段發揮重要調控作用，在紅系分化早期通過促進細胞從G1向S期轉變促進細胞增殖，而細胞周期的退出在紅系終末分化中起重要作用[11-12]。表明PTP4A3參與調控紅系細胞脫核，但是否通過其磷酸酶功能發揮作用以及具體的分子機制仍需更深入研究。