三種水楊醛席夫堿熒光探針的合成及對Zn2+的識別

李中燕 覃海波 朱洪宇 樊 旭 袁 霖

(湖南科技學院化學與生物工程學院，永州 425199)

0 引 言

金屬元素廣泛存在于環境及生命體當中，有些金屬元素對生命體的構成是必不可少的，而有些金屬元素則對生物具有高毒性。鋅是人體必需的微量元素之一，在調節機體代謝、維持人體正常生理功能等方面有著非常重要的作用，具有“生命的火花塞”“智力之源”等美譽。組成人體的元素有60多種，而鋅在人體內的含量約為0.004%，是僅次于鐵的第二大微量元素[1-2]。Zn2+在基因表達、金屬酶調節、DNA合成和細胞新陳代謝等多種生理過程中均起著重要作用，如果人體內Zn2+代謝紊亂，會導致多種疾病。缺少Zn2+會引起消化不良、食欲不振，缺鋅兒童的生長發育受到嚴重影響而出現缺鋅性侏儒癥等癥狀；另一方面，Zn2+過量會導致一些毒性癥狀和神經退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森氏病、癲癇癥、肌萎縮、家族性脊髓側索硬化癥等[3-5]。因此，設計、合成具有高選擇性、高靈敏度的Zn2+熒光探針具有非常重要的意義。

目前，傳統的金屬離子檢測方法主要有色譜法、高效液相色譜法、電化學分析法、原子吸收光譜法和質譜法等[6-9]。但是這些方法都存在一定的局限性，檢測時間長、檢測成本高等因素限制了其在實際檢測工作中的廣泛使用。熒光探針作為一種新型的金屬離子檢測法，具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單、分析效率高、響應用時短、不會損壞樣品等諸多其他傳統檢測方法所沒有的優點，在金屬離子檢測中備受關注，在分析化學、生物化學和醫藥科學等多個領域里得到了普遍應用[10-13]。

席夫堿類熒光探針由于其合成條件溫和且具有良好的配位能力而得到化學工作者的廣泛關注[14-18]。我們以水楊醛及其衍生物與三羥甲基氨基甲烷為原料合成了3種新型的熒光探針L1～L3(Scheme 1)，并通過光譜實驗研究了探針對Zn2+的選擇性識別檢測。

Scheme 1 Synthesis of probes L1-L3

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器有AVANCE Ⅲ HD 400 MHz核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)、UV-2401 PC紫外分光光度計(日本島津公司)、RF-6000熒光分光光度計(日本島津公司)、UPH-Ⅲ-10TN超純水機(四川優普超純科技有限公司)。

水楊醛(salicylaldehyde)、5-氯水楊醛(5-chlorosalicylaldehyde)、4-甲氧基水楊醛(4-methoxysalicylaldehyde)、三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane)均為分析純(上海泰坦科技股份有限公司)。其他試劑均為國產分析純。所用金屬離子為其相應的硝酸鹽或鹽酸鹽。實驗用水為超純水。

1.2 探針L1～L3的合成及表征

探針的合成路線如Scheme 1所示。于50 mL圓底燒瓶中加入水楊醛或取代水楊醛(1 mmol)、三羥甲基氨基甲烷(121 mg，1 mmol)和15 mL無水乙醇，然后在80℃的油浴中加熱回流4 h。反應結束后，真空旋轉蒸發除去多余溶劑，加入少量乙醇洗滌，抽濾，烘干，得到固體粉末。

L1：淡黃色固體，產率91%。m.p.158～159℃。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ14.54(s，1H)，8.56(s，1H)，7.41(dd，J=7.9，1.6 Hz，1H)，7.33～7.18(m，1H)，6.87～6.68(m，2H)，4.76(s，3H)，3.62(d，J=4.3 Hz，6H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ164.91，163.84，132.81，132.62，118.92，117.87，117.58，67.50，61.78。元素分析按C11H15NO4的計算值(%)：C 58.66，H 6.71，N 6.22；實驗值(%)：C 58.23，H 6.93，N 6.01。HRMS按 C11H15NO4的計算值(m/z)：226.107 9[M+H]+；實驗值：226.108 0。

L2：橙色固體，產率96%。m.p.145～146℃。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ14.71(s，1H)，8.54(s，1H)，7.52(d，J=2.7 Hz，1H)，7.28(dd，J=9.0，2.7 Hz，1H)，6.77(d，J=9.0 Hz，1H)，4.84(s，3H)，3.61(s，6H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ164.43，164.10，132.92，131.57，120.63，119.96，119.16，67.55，61.51。元素分析按 C11H14ClNO4的計算值(%)：C 50.88，H 5.43，N 5.39；實驗值(%)：C 50.64，H 5.66，N 5.12。HRMS 按 C11H14ClNO4的計算值(m/z)：260.069 0[M+H]+；實驗值：260.069 3。

L3：淺棕色固體，產率90%。m.p.141～142℃。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ14.20(s，1H)，8.27(s，1H)，7.16(d，J=8.8 Hz，1H)，6.11(dd，J=8.8，2.4 Hz，1H)，6.04(d，J=2.4 Hz，1H)，5.02(s，3H)，3.71(s，3H)，3.61(s，6H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ174.80，165.50,162.46,135.07，111.32，105.33，102.35，65.56，61.40，55.41。元素分析按C12H17NO5的計算值(%)：C 56.46，H 6.71，N 5.49；實驗值(%)：C 56.21，H 6.90，N 5.25。HRMS 按 C12H17NO5的計算值(m/z)：256.118 5[M+H]+；實驗值：256.118 8。

1.3 光譜性質測試

將探針L1～L3溶于乙醇制得探針儲備液(2 mmol·L-1)。配制金屬離子(Na+、K+、Ag+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Sn2+、Fe3+、Cr3+、Al3+)儲備液(2 mmol·L-1)用于金屬離子的選擇性檢測。將4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶于超純水中制備0.1 mg·mL-1的溶液，并用稀HCl和NaOH調節至pH=7.47，作為緩沖溶液。檢測體系為EtOH-H2O(9∶1，V/V，pH=7.47)。

進行熒光滴定實驗時，移取20 μL探針儲備液(2 mmol·L-1)，加入適量的Zn2+和緩沖溶液，然后加入乙醇定容至2 mL，熒光光譜測定條件：λex=381 nm，λem=390～650 nm，激發/發射狹縫寬度為3 nm/3 nm。紫外可見吸收滴定實驗：移取20 μL探針儲備液(2 mmol·L-1)，加入適量的Zn2+和緩沖溶液，然后加入乙醇定容至2 mL，測定UV-Vis吸收光譜。

1.4 單晶X射線衍射

為研究探針L2與Zn2+離子的結合方式，制備了配合物L2-Zn2+晶體。于50 mL圓底燒瓶中加入探針L2(518 mg，2 mmol)、醋酸鋅(183 mg，1 mmol)和 15 mL無水乙醇，然后在80℃的油浴中加熱回流1 h。反應結束后靜置冷卻，24 h后有淡黃色晶體析出。選取尺寸為0.40 mm×0.38 mm×0.34 mm的配合物L2-Zn2+晶體，置于Bruker APEX Ⅱ CCD單晶衍射儀上，在室溫下進行單晶X射線衍射分析，采用經石墨單色化的MoKα輻射(λ=0.071 073 nm)作為衍射光源。數據收集、晶胞確定、數據還原和吸收校正通過multi-scan進行，并通過SIR2004的直接方法求解結構。對全部非氫原子坐標及其各向異性熱參數用SHELXL-97程序進行全矩陣最小二乘法修正；氫原子均為理論加氫。配合物L2-Zn2+的晶體學數據見表1。

CCDC：2121021，L2-Zn2+。

表1 配合物L2-Zn2+的晶體學數據Table 1 Crystallographic data of complex L2-Zn2+

2 結果與討論

2.1 探針L2與L2+Zn2+的UV-Vis吸收光譜

探針L2分子中亞胺上的N和酚羥基中的氧原子均易與Zn2+配位，導致分子剛性增強，從而引起探針L2光譜性質的變化。在EtOH-H2O(9∶1，V/V，pH=7.47)中對L2的UV-Vis光譜性質進行了研究，如圖1所示。探針L2本身在333和414 nm處有2個吸收帶，隨著加入的Zn2+濃度增加，L2在414 nm處的吸光度下降，而370 nm處的吸光度增大，且在333和400 nm處出現等吸收點，表明L2與Zn2+形成配合物。UV-Vis吸收光譜吸收帶紅移的原因可能是探針L2與Zn2+配合后，使得L2分子中C=N異構化受阻，增加了分子的剛性和體系的共軛程度。

圖1 不同濃度Zn2+存在時探針L2的UV-Vis吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of L2 in the presence of Zn2+with different concentrations

2.2 探針L2與L2+Zn2+的熒光光譜

如圖2所示，在前述的熒光光譜測試條件下，探針L2本身幾乎沒有熒光，這可能是因為探針L2分子中存在C=N雙鍵異構化，加劇了激發態下的非輻射躍遷，使探針本身幾乎不發射熒光。隨著Zn2+的加入，探針L2在462 nm處的熒光強度顯著增強，發出強的藍色熒光，熒光強度增強高達88倍，這可能是由于探針分子與Zn2+結合，使得探針分子的異構化受阻，同時增加了分子的剛性，產生螯合型熒光增強，由此可實現對Zn2+的識別檢測。

圖2 Zn2+對探針L2熒光光譜的影響Fig.2 Effect of Zn2+on fluorescence spectra of probe L2

如圖3所示，熒光滴定實驗表明，在0～20 μmol·L-1范圍內，隨著加入的Zn2+濃度的升高，體系的熒光強度不斷增強，在16～20 μmol·L-1范圍內，462 nm處的熒光強度趨于穩定。而且體系的熒光強度與Zn2+的濃度在 0～10 μmol·L-1范圍內具有良好的線性關系(圖4)，相關系數為 0.987 34，檢出限為11.96 nmol·L-1，遠低于國標GB5749-2006《生活飲用水衛生標準》規定的飲水中Zn2+的限量值1.0 mg·L-1(約15 μmol·L-1)，說明探針L2可以高效識別檢測Zn2+。

圖3 不同濃度Zn2+存在時探針L2的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of probe L2 in the presence of Zn2+with different concentrations

圖4 Zn2+濃度與探針L2熒光強度的線性關系Fig.4 Linear relationship between the concentration of Zn2+and the fluorescence intensity of probe L2

2.3 pH對熒光強度的影響

在前述的熒光光譜測試條件下，考察了pH對探針L2及L2+Zn2+的熒光光譜的影響。如圖5所示，探針L2本身的熒光強度非常弱，而且pH對L2的熒光強度幾乎沒有影響。而探針L2+Zn2+體系的熒光強度受pH影響較大，在pH=7.0～8.0時體系熒光強度最大且基本不受溶液酸堿度的影響；當pH＜7.0或pH＞8.0時熒光強度會迅速降低。這可能是體系酸性過大時會導致C=N基團的分解，而堿性過大時會使體系中的Zn2+形成Zn(OH)2，兩者都不利于探針L2與Zn2+的配合。L2+Zn2+體系在pH=7.47時熒光強度最強，故選擇測試pH=7.47，緩沖體系為HEPES緩沖液。

圖5 pH對探針L2(10 μmol·L-1)和L2+Zn2+體系熒光強度的影響Fig.5 Effect of pH on the fluorescence intensities of probe L2 and L2+Zn2+system

2.4 離子選擇性和抗干擾性

考察了采用探針L2檢測Zn2+的選擇性。如圖6所示，在含有10 μmol·L-1探針L2的EtOH-H2O(9∶1，V/V，pH=7.47)體系中分別加入 20 μmol·L-1的 Na+、K+、Ag+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Sn2+、Fe3+、Cr3+和Al3+，只有Zn2+能使探針L2的熒光強度顯著增強，表明探針對Zn2+有特異性響應。進一步考察了共存離子的影響，除了Cu2+和Ni2+，其他離子對體系熒光強度的影響不明顯。Cu2+和Ni2+會明顯減弱體系的熒光，可能是由于這2種離子具有順磁性，能夠與配體發生電子或能量轉移而導致熒光猝滅。但是這2個體系依然具有較強的熒光強度，分別是探針L2熒光強度的7.5倍和11.2倍，這表明探針L2在上述共存離子存在下可以有效地選擇性識別檢測Zn2+。

圖6 探針L2對金屬離子的選擇性，以及Zn2+與其他金屬離子共存時L2在462 nm處的熒光強度Fig.6 Selectivity of probe L2 for metal ions and the fluorescence intensity of L2 at 462 nm when Zn2+coexists with other metal ions

2.5 探針L2與Zn2+的結合模式

圖7為利用等物質的量連續變換法測定的結合比曲線，據此可以確定探針L2與Zn2+的結合比為2∶1。

圖7 探針L2與Zn2+相互作用的Job圖Fig.7 Job′s plot for interaction between L2 and Zn2+

進一步運用核磁滴定法探究了L2與Zn2+的結合模式。將L2溶于DMSO-d6，并加入等量的Zn2+，結果如圖8a、8b所示，酚羥基在δ=14.71的質子峰(H1)消失，發生去質子化，亞胺的質子峰(H2)由δ=8.56移動到8.29，苯環上的質子峰(H3、H4、H5)均向高場發生了移動，羥甲基中的羥基質子峰變寬且向低場移動。由此可見，探針L2中的亞胺N原子、酚羥基中的氧原子與羥甲基中的氧原子參與了L2與Zn2+的配位。綜上所述，根據等物質的量連續變換法及核磁滴定結果，推斷L2與Zn2+可能的結合模式如圖8c所示。

圖8 (a)L2+Zn2+和(b)單獨的L2的1H NMR譜圖;(c)L2與Zn2+可能的結合模式Fig.8 1H NMR spectra of(a)L2+Zn2+and(b)L2 only;(c)Proposed binding mode of L2 and Zn2+

為了進一步研究探針L2與Zn2+的結合模式，我們在乙醇溶液中培養了配合物L2-Zn2+的晶體。配合物L2-Zn2+的晶體結構如圖9所示。結構分析顯示，探針L2與Zn2+以物質的量之比2∶1配位，探針L2中的C=N基團中的N原子、酚羥基中的氧原子以及羥甲基中的氧原子均參與了L2與Zn2+的配位，同時酚羥基發生了去質子化，這也與核磁數據相吻合。

圖9 L2-Zn2+的50%概率晶體結構橢球圖Fig.9 Crystal structure of L2-Zn2+shown as ellipsoids with 50% probability

2.6 取代基對探針L1～L3熒光光譜的影響

為了探究取代基(H、Cl、OCH3)對探針熒光性能的影響，考察了探針L1～L3對Zn2+的熒光響應性，如圖10所示。結果表明，含Cl原子的探針L2的熒光響應最強，其次是無取代基的探針L1，含OCH3基團的探針L3最弱。這可能是因為中間體M的穩定性與探針中取代基的電負性有關：M(Cl)＞M(H)＞M(OCH3)，而中間體M越容易生成就越有利于探針與Zn2+的結合，與圖8c所示的結合模式相吻合。

圖10 探針L1～L3對Zn2+的熒光響應Fig.10 Fluorescence response of L1-L3 to Zn2+

2.7 水樣中Zn2+的檢測

以自來水和瀟水河水為研究對象，測試了探針L2對實際水樣中Zn2+的檢測效果，如表2所示，2種水樣的加標回收率分別為99.2%～102.5%和100.8%～104.3%，相對標準偏差(RSD)均小于5%。數據表明探針L2可以用于實際水樣中Zn2+的檢測。

表2 L2對自來水和河水中的Zn2+的檢測Table 2 Determination of Zn2+by L2 in tap water and river water

3 結 論

以取代水楊醛和三羥甲基氨基甲烷為原料，通過簡單的反應合成了3種新型的席夫堿類熒光探針探針L1～L3，其中探針L2對Zn2+表現出出色的選擇性和靈敏度。探針L2與Zn2+可形成配合物引起體系熒光增強，發出明亮的藍色熒光，檢出限為11.96 nmol·L-1。通過1H NMR 等方法對L2 與Zn2+的結合模式進行了探索。結果表明，探針L2中的亞胺N原子、酚羥基中的氧原子與羥甲基中的氧原子參與了L2與Zn2+的配位。配合物L2-Zn2+的單晶結構和Job曲線證實探針L2與Zn2+以物質的量之比2∶1配位。同時，探針L2在實際水樣中的性能測試表明該探針在檢測環境中的Zn2+方面具有潛在的應用價值。