產幾丁質脫乙酰酶Lysinibacillus macroides ZCGT05的篩選及酶學性質研究

苗德升，丁志雯，李甜，李澤信，陳佳雨，錢亮亮，房耀維，劉姝*

(1.江蘇海洋大學 食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005；2.連云港市質量技術 綜合檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222006)

幾丁質是一種含氮的多糖物，又稱甲殼質、甲殼素等，是自然界中含量非常豐富的生物聚合物[1]。幾丁質難溶于一般的酸堿，化學性質非常穩定，這是制約其開發應用的重要原因[2]。殼聚糖是幾丁質脫除乙酰基后的多糖化合物，經脫乙酰基后的殼聚糖雖然不溶于水、堿溶液和有機溶劑，但可溶于稀酸溶液，在醫藥、化工等領域有廣泛的研究和應用[3-4]。

目前，化學法是工業化生產殼聚糖的主要方法，該方法以幾丁質為原料，通過濃堿處理，得到的產品脫乙酰度不均一，且反應過程中易生成有毒物質，會造成嚴重的環境污染[5]。生物法利用幾丁質脫乙酰酶催化幾丁質脫乙酰基，對幾丁質分子的主鏈不發生降解，可以制備出脫乙酰度均一的殼聚糖[6]。雖然生物法利用幾丁質脫乙酰酶催化幾丁質具有安全環保、產品性質較穩定等優點[7]，但存在幾丁質脫乙酰酶活力較低、催化溫度較高等問題[8]。因此，本研究篩選低溫產幾丁質脫乙酰酶菌株，為開發生物酶法工業制備殼聚糖所用的幾丁質脫乙酰酶制劑奠定了試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

海底泥樣：采集于高公島海域。

1.2 培養基

富集培養基：殼聚糖2.5 g/L，磷酸氫二鉀0.7 g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈉0.1 g/L，蒸餾水配制，pH 7.0。

篩選培養基：幾丁質2 g/L，磷酸氫二鉀0.7 g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，對硝基乙酰苯胺0.2 g/L，瓊脂20 g/L，陳海水配制，pH 7.0。

發酵培養基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，MgSO40.5 g/L，陳海水配制，pH 7.0。

1.3 儀器設備

SW-CJ-1D 超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；JXN-26 高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；分光光度計 杭州明基科學儀器有限公司；PCR儀 德國Eppendorf有限公司；Nikon 90i全電動顯微鏡 上海普赫光電科技有限公司；SPX-250B-2 生化培養箱 上海博迅實業有限公司。

1.4 低溫產幾丁質脫乙酰酶菌株的篩選

初篩：稱取5 g泥樣置于50 mL富集培養基中，于25 ℃，180 r/min條件下培養3 d。吸取富集樣液用滅菌陳海水稀釋10倍。將稀釋液涂布于篩選培養基中，于25 ℃條件下培養3～5 d。

復篩：將初篩得到的菌株轉接到種子培養液中，再以3%的接種量接種至發酵培養基，在25 ℃，180 r/min條件下培養3 d后將發酵液離心，測定發酵上清液中幾丁質脫乙酰酶的酶活。

1.5 幾丁質脫乙酰酶酶活力的測定

對硝基乙酰苯胺標準曲線的繪制：精準稱取0.01 g對硝基乙酰苯胺倒入燒杯中，加入少量蒸餾水，用磁力攪拌器加熱攪拌，使之溶解，冷卻后定容到100 mL容量瓶中，混勻。取6支具塞比色管，用蒸餾水進行梯度稀釋，最終對硝基乙酰苯胺溶液的濃度分別為0，2，4，6，8，10 mg/L。以蒸餾水作參比，測定各管在400 nm處的吸光值(A400)。以對硝基乙酰苯胺濃度為橫坐標、400 nm處的吸光度為縱坐標繪制標準曲線[9]。

酶活的測定：在離心管中加入25 ℃、pH 7.0的磷酸緩沖液，對硝基乙酰苯胺溶液1 mL，酶液1 mL，25 ℃水浴孵育15 min，沸水浴終止酶促反應，離心后測定上清液的吸光度。以添加1 mL同樣濃度沸水浴滅活15 min的酶液作為對照。

酶活單位(U)定義：將該反應體系中每1 h產生1 μg對硝基乙酰苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位。

1.6 菌株ZCGT05的鑒定

根據伯杰氏細菌鑒定手冊，對菌株進行形態學觀察和生理生化鑒定。利用基因組提取試劑盒提取的菌株基因組DNA為模板，利用通用引物進行16S rDNA的擴增。擴增產物送至基因測序公司進行測序，所得的序列上傳至GenBank，通過Blast程序與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，并用MEGA 11.0軟件構建進化樹。

1.7 L. macroides ZCGT05幾丁質脫乙酰酶酶學性質研究

1.7.1 溫度對L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶活性和穩定性的影響

根據上述酶活測定方法，采用pH 7.0的磷酸緩沖液，在溫度為10，15，20，25，30，35，40 ℃下進行酶活測定。將反應液在上述溫度下保溫0～10 h，每隔2 h進行1次酶活測定，以各個溫度下0 h的酶活為100%，研究其溫度穩定性。

1.7.2 pH對L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶活性和穩定性的影響

根據上述酶活測定方法，將溫度保持在25 ℃，在pH為5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9條件下進行酶活測定。將反應液在上述pH下保溫0～10 h，每隔2 h進行1次酶活測定，以各個溫度下0 h的酶活為100%，研究其pH穩定性。

1.7.3 金屬離子對L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶活性的影響

根據上述酶活測定方法，在反應體系中加入相同離子濃度的金屬鹽KCl、ZnCl2、CaCl2、FeSO4、CuSO4、CoCl2、MgSO4、MnSO4，并進行酶活測定。

2 結果與分析

2.1 產幾丁質脫乙酰酶菌株的篩選

取富集培養后的樣品稀釋液涂布于篩選培養基上，通過變色圈法篩選得到5株產黃色變色圈明顯的菌株，變色圈最大的菌株為ZCGT05，見表1及圖1。

表1 產幾丁質脫乙酰酶菌株的篩選Table 1 Screening of chitin deacetylase-producing strains

圖1 菌株ZCGT05在篩選平板上的變色圈Fig.1 The discoloration circle of ZCGT05 strain on the screening plate

菌株轉接入種子培養液中培養，再以3%的接種量接種至發酵培養基，在25 ℃，180 r/min的條件下培養72 h后將發酵液于8000 r/min離心10 min，測定發酵上清液中幾丁質脫乙酰酶的酶活。菌株ZCGT05酶活最高，達到10.18 U/mL。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株ZCGT05的形態學特征

由圖1可知，菌株ZCGT05在2216E培養基上25 ℃培養3 d，菌落呈圓形，淡黃色，半透明，表面濕潤，邊緣規則，無暈環，中央突起，直徑在0.5～0.8 cm，易挑取。

2.2.2 菌株ZCGT05的生理生化特征

菌株ZCGT05的生理生化試驗結果見表2。

表2 菌株ZCGT05的生理生化試驗結果Table 2 Physiological and biochemical test results of ZCGT05 strain

由表2可知，明膠液化試驗、H2O2試驗、檸檬酸鹽試驗均呈陽性，吲哚試驗、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、果糖、反硝化試驗均為陰性。根據形態學特征，結合生理生化結果，初步將菌株ZCGT05鑒定為Lysinibacillusmacroides。

2.2.3 菌株ZCGT05的16S rDNA擴增及分析

將PCR產物送至南京思普金公司測序，所得序列提交GenBank(登錄號：MK263030)。將該序列與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，發現與菌株Lysinibacillusmacroides(登錄號：NR114920.1)16S rDNA相似性最高，達到99%。用MEGA 11.0軟件進行16S rDNA序列的比對分析，并構建系統發育樹，菌株ZCGT05與Lysinibacillusmacroides親緣關系最近，見圖2。目前，尚未見延長賴氨酸芽孢桿菌產幾丁質脫乙酰酶的報道。

圖2 基于16S rDNA序列菌株L. macroides ZCGT05的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of L. macroides ZCGT05 based on 16S rDNA sequence

2.3 L. macroides ZCGT05幾丁質脫乙酰酶酶學性質研究

2.3.1 溫度對L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶活性的影響

以對硝基乙酰苯胺濃度為橫坐標、400 nm處的吸光度為縱坐標繪制標準曲線(見圖3)。線性方程為：y=0.0586x+0.0038，R2為0.9992，吻合度較高。

圖3 對硝基乙酰苯胺標準曲線Fig.3 The standard curve of p-nitroacetanilide

圖4 溫度對L. macroides ZCGT05幾丁質脫乙酰酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

由圖4可知，隨著溫度的升高，相對酶活先上升后下降，當溫度為25 ℃時酶活最高，故該酶的最適溫度為25 ℃。目前，幾丁質脫乙酰酶的最適催化溫度為30～60 ℃，多數催化溫度為50～60 ℃，低溫幾丁質脫乙酰酶鮮有報道。秦汪艷等[10]報道了菌株Peniciliumjanthinellum幾丁質脫乙酰酶的最適溫度為30 ℃；菌株ColletotrichumgloeosporioidesCF-6幾丁質脫乙酰酶的最適溫度為28 ℃[11]。菌株L.macroidesZCGT05產幾丁質脫乙酰酶的最適溫度為25 ℃，在工業應用中可節省用于加熱提高反應溫度的能耗。

2.3.2 溫度對L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶穩定性的影響

圖5 溫度對L. macroides ZCGT05幾丁質 脫乙酰酶穩定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

通過測定菌株L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶在不同溫度(15～30 ℃)下水浴不同時間后的相對酶活來研究酶的熱穩定性。由圖5可知，25 ℃水浴10 h后相對酶活仍達到80%，30 ℃水浴10 h后相對酶活僅為26%。

2.3.3 pH對L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶活性的影響

圖6 pH對L. macroides ZCGT05幾丁質 脫乙酰酶活性的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

由圖6可知，隨著pH增大，相對酶活先上升后下降，當 pH為7.0時酶活最高，該酶的最適pH為7.0。目前報道的幾丁質脫乙酰酶的最適pH為3.5～12.0，多數為偏酸性。只有菌株Aspergillusflavus和菌株Micromonosporaaurantiaca幾丁質脫乙酰酶最適pH為7.0[12-13]。

2.3.4 pH對L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶穩定性的影響

圖7 pH對L. macroides ZCGT05幾丁質 脫乙酰酶穩定性的影響Fig.7 Effect of pH on the stability of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

將菌株L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶在不同pH(6.5～8.5)下孵育不同時間后測定其相對酶活，結果表明，孵育時間越長相對酶活越低。由圖7可知，不同pH條件下的相對酶活在孵育2 h內均能達到80%以上，但孵育10 h后，pH為6.5和8.5條件下的相對酶活較低，pH 7.5條件下的相對酶活在孵育10 h后仍可達到81%。

2.3.5 金屬離子對L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶活性的影響

金屬離子對L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶活性的影響見圖8。

圖8 金屬離子對L. macroides ZCGT05幾丁質 脫乙酰酶活性的影響Fig.8 Effect of metal ions on the activity of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

由圖8可知，Co2+、Mg2+、Mn2+對酶活有促進作用，Zn2+、Ca2+對酶活的促進作用相對較低，而K+、Fe2+、Cu2+對酶活具有抑制作用。不同來源的幾丁質脫乙酰酶受金屬離子對其酶活的影響各有不同，如Mn2+對Bacillusamyloliquefaciens Z7幾丁質脫乙酰酶有強烈抑制作用， Fe2+對Bacillusamyloliquefaciens Z7的酶活具有一定促進作用[14-15]。

3 結論

本研究從連云港市海州灣海域海泥樣品中篩選獲得了一株產幾丁質脫乙酰酶細菌菌株ZCGT05，通過菌落形態觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析將該菌株鑒定為Lysinibacillusmacroides。L.macroidesZCGT05幾丁質脫乙酰酶最適溫度和pH分別為25 ℃和7.0，在20～25 ℃保溫2 h，殘留酶活高于85%；在pH 7.0～8.0孵育2 h，殘留酶活高于90%。Co2+、Mg2+、Mn2+對酶活有顯著激活作用，而Cu2+對酶活有顯著抑制作用。