加熱溫度對羅漢果香料制備的影響研究

許春平，王宣靜，高明奇，張弛，楊雯靜，邢雨晴，朱麗，黃家樂，郝輝*

(1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，鄭州 450001; 2.河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州 450016)

羅漢果，又名長壽果，廣泛分布于廣西、江西、湖南、廣東、貴州等地，是我國特有的經濟、藥用植物，被列為“藥食同源”品種，果實中含有豐富的葡萄糖、蛋白質、脂類等[1]，具有止咳祛痰、抑菌、抗氧化等藥理作用, 被廣泛開發為食品、保健食品和藥品。

美拉德反應發生在羰基化合物和氨基化合物間，是目前較為流行的一種香料生產應用技術，在食品、醫藥和香料等領域廣泛應用[2-3]。糖類在高溫條件下熔融經過一系列反應變為黑褐色物質的過程，稱為焦糖化作用[4-5]。在酸、堿條件下均可進行，糖在強熱的情況下生成兩類物質:一類是糖的脫水產物，即焦糖或醬色；另一類是裂解產物，即一些揮發性的醛、酮類物質，它們進一步縮合、聚合，最終形成深色物質。

目前，關于羅漢果的研究多集中于其生物活性成分方面[6-7]，本研究通過將羅漢果提取物與葡萄糖焦糖化料液進行摻配后進行不同溫度的加熱反應制備羅漢果香料，通過GC-MS分析及主成分分析對其揮發性成分進行探索，結合嗅香評價判斷最優的反應條件，為羅漢果的應用提供了數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅漢果：購自廣西壯族自治區桂林市。

試劑：氫氧化鈉、二氯甲烷(AR，滄州天工化工產品有限責任公司)；乙酸苯乙酯(色譜純，蘇州鼎亞化工有限公司)；食用葡萄糖(內蒙古阜豐生物科技有限公司)；無水碳酸鈉、無水硫酸鈉(分析純，天津大茂化學試劑廠)。

儀器：1000C不銹鋼粉碎機 永康市紅太陽機電有限公司；TGL-16M離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；集熱式磁力攪拌器、DF-101S油浴鍋 上海予申儀器有限公司；同時蒸餾萃取裝置 鄭州長城科工貿有限公司；Agilent GC6890-MS5973N 型氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅漢果提取物的制備

將羅漢果粉碎后過20目篩，準確稱取200 g羅漢果粉，加入4000 mL水，在60 ℃下攪拌6 h后離心，在濾渣中加入2000 mL水繼續在60 ℃下攪拌2 h后離心，合并濾液，將濾液旋轉蒸發，得到羅漢果提取物52.54 g。

1.2.2 葡萄糖焦糖化料液的制備

根據預實驗，準確稱取100 g無水葡萄糖，加入糖質量20%的無水碳酸鈉作為反應助劑，加入250 mL水，超聲攪拌均勻后在160 ℃的油浴鍋中加熱30 min，制備焦糖化料液。

1.2.3 摻配料進行加熱反應

將羅漢果提取物與葡萄糖焦糖化料液按3∶1的比例進行摻配，用1 mol/L的NaOH溶液調pH為7，將摻配料分為5份并標號A、B、C、D、E，在油浴鍋中進行加熱反應，時間設置為1 h，對應溫度分別設置為80，100，120，140，160 ℃。

1.2.4 萃取香味物質

加熱反應結束后，各取1 mL反應物加入30 mL二氯甲烷，超聲萃取1 h，在50 mL分液漏斗中靜置30 min，分液后在二氯甲烷萃取液中加入10 g無水硫酸鈉，然后在35 ℃的水浴鍋中進行濃縮，濃縮后用注射器過孔徑為0.22 μm的有機濾膜轉移至氣質樣品瓶中，加入50 μL濃度為0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯(內標物)，以備GC-MS分析。以內標法對物質進行定量分析。揮發性物質含量(μg/mL)=[內標物質量(μg)×揮發性物質峰面積]/[內標物峰面積×樣品體積(mL)][8]。

1.2.5 GC-MS條件

GC條件：色譜柱：HP-5MS(60 m×250 μm×0.25 μm)；載氣(He)流速3 mL/min；進樣量 1 μL；升溫程序： 50 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；進樣口溫度：280 ℃；分流比：10∶1。

MS條件：EI離子源；離子源溫度270 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃；采集模式：Scan；掃描范圍：35～550 m/z。

1.2.6 主成分分析方法

采用軟件IBM SPSS Statistics 22.0進行檢驗，采用PCA統計建立樣品與各揮發性組分之間的關系。

1.2.7 嗅香評價

準確稱取1 g羅漢果提取物，用5 mL去離子水溶解，溶解后置于密閉的磨口瓶中，由6名受過專業訓練的感官評定員組成的感官評定小組進行嗅香評價，嗅其揮發性香氣，分辨其香氣特色，評定其類型、風格[9]。

2 結果與分析

2.1 不同加熱溫度樣品揮發性成分的GC-MS 結果分析

5個樣品的揮發性成分經GC-MS 檢測結果見表1。

表1 不同加熱溫度樣品揮發性成分含量Table 1 Content of volatile components in samples heated at different temperatures μg/mL

續 表

續 表

由表1可知，5個樣品已鑒定出的揮發性成分主要包括醇類、酸類、醛類、酮類、酚類、烷烴類、烯烴類、酯類、胺類等，A、B、C、D、E樣品的揮發性物質種類分別有25，33，24，20，21種，其中樣品B(反應溫度為100 ℃)鑒定出的揮發性成分種類最多；對應的揮發性成分總量依次為437.42，593.45，653.93，733.41，684.36 μg/mL。其中樣品D(反應溫度為140 ℃)鑒定出的揮發性成分含量最多。

其中醛類、酮類、酯類在總含量中占比較大，醛類物質的總含量隨著反應溫度的升高逐漸升高，5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural,5-HMF)是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下水解產生的一種呋喃類化合物，是焦糖化反應和美拉德反應的典型產物之一[10-12]。章銀良等[13]認為美拉德反應是5-HMF形成的重要途經，并對酪蛋白-木糖模擬體系進行研究發現， 5-HMF的生成量隨著反應溫度和時間的增加相應增加，同時其產物對DPPH自由基的清除率也相應增大。楊楠等[14]將油茶籽進行紅外加熱處理后發現，隨著反應時間的延長，油茶籽內5-HMF等美拉德反應產物的生成量逐漸增多。相同反應時間內，5-HMF形成量隨著反應溫度的升高而增加。近年來5-HMF的生物活性受到人們的廣泛關注，有研究發現5-HMF具有抗氧化、改善學習記憶、抗過敏、保護神經細胞等對人體有益的作用[15-16]。

酮類物質、酯類物質的總含量隨著反應溫度的升高先上升后下降，在140 ℃時達到最高。2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮是一種白色結晶物質, 低溫下比較穩定，加熱后所得到的混合物具有焦甜和融熔黃油的香味[17]。吡喃酮、呋喃酮、烯醇酮等物質多為美拉德反應的特征產物，一般風味閾值較低，對產物香味有較好影響。 酯類物質自身具有果香、花香、蜂蜜香等芳香氣味，還能夠調和其他物質的刺激感和苦味。己二酸二異辛酯略有氣味，屬于增塑劑，雖然在樣品中含量占比較大，但對整體氣味的貢獻較低。

2.2 主成分分析

利用主成分分析對不同加熱溫度羅漢果樣品中59種揮發性成分進行分析[18]，得到4種主成分特征值和貢獻率(見表2)、載荷矩陣表(見表3)。

表2 4種主成分的特征值和貢獻率Table 2 Characteristic values and contribution rates of four principle components

由表2可知，第1主成分的貢獻率為45.451%, 第2主成分的貢獻率為31.535%, 第3主成分的貢獻率為13.534%，主成分1，2，3的累計貢獻率達到90.520%，基本代表了樣品主要揮發性成分的組成, 反映了原始變量的絕大部分信息, 達到了降維目的。說明羅漢果中59種揮發性成分，可以用主成分1，2，3進行主成分分析。

表3 主成分載荷矩陣

續 表

由主成分載荷矩陣表(見表3)可以得出在主成分1中，載荷值較高的正影響揮發性成分有2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、二十三烷、角鯊烯、17-戊三酮等，載荷值依次是0.982，0.979，0.974，0.969，主要指向酚類、烴類、酮類物質；負影響最大的為六氫-3-(2-甲基丙基)-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，載荷值為-0.872。在主成分2中，載荷值較高的正影響揮發性成分有六氫-3-(2-甲基丙基)-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、1-十九碳烯、正二十烷、17-戊三酮等物質，載荷值依次是0.427，0.351，0.282，0.233，主要指向酮類、烴類物質；負影響最大的為己二酸二(2-乙基己)酯，載荷值為-0.971。在主成分3中，載荷值較高的正影響揮發性成分有1-[對溴苯基]-4-硝基-1,3-丁二烯、17-甲基-5-α-雄甾-2-烯-17-β-醇、2,4′-二羥基-3′-甲氧基苯乙酮、8-羥基-2,5-二甲基氫氧化物內鹽噻唑[3,2-a]吡啶、O2-丁基O1-(2-甲基丙基)苯-1,2-二羧酸酯等物質，載荷值依次是0.288，0.288，0.288，0.288，0.288，主要指向烴類、醇類、酮類、雜環類等物質；負影響最大的為3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮，載荷值為-0.839。主成分載荷矩陣顯示了各變量與各主成分之間的關系，數值的絕對值越大，表明該指標與某一主成分的聯系緊密程度越大，反映了該指標在該主成分上的載荷程度；載荷值小的揮發性成分對羅漢果的揮發性風味貢獻小，同時也表明其含量極低或未檢出[19]。

計算上述多元變量和方差遞減排列得出5個樣品中的第1、第2、第3主成分值，然后以得分為坐標生成旋轉空間分散圖見圖1、旋轉空間成分圖見圖2。

圖1 不同溫度處理的5個樣品的旋轉空間分散圖Fig.1 Rotational spatial dispersion diagram of five samples treated at different temperatures

圖2 不同溫度處理的5個樣品的旋轉空間成分圖Fig.2 Rotational spatial composition diagram of five samples treated at different temperatures

由圖1可知，5個樣品根據距離遠近可分為3個區域，3個區域內樣品彼此間差異較大，A樣品與E樣品各自分為一個區域，B、C、D樣品彼此距離較近分為一個區域，表明B、C、D樣品的主成分差異較小。

由圖2可知，對A樣品特征香氣影響較大的香味物質主要包括17-甲基-5-α-雄甾-2-烯-17-β-醇、正十八烷、正二十四烷等；對B樣品特征香氣影響較大的香味物質主要包括1-二十二烯、1-十九碳烯、棕櫚酸甲酯等；對C樣品特征香氣影響較大的香味物質主要包括糠醛、3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮、3-甲基二十烷等；對D樣品特征香氣影響較大的香味物質主要包括2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、香草醛等；對E樣品特征香氣影響較大的香味物質主要包括2-乙酰基吡咯、糠醇、5-羥甲基糠醛等。

2.3 嗅香評價

綜合各評價員的嗅香結果，見表4。

表4 5個羅漢果樣品嗅香評價表Table 4 Olfactory evaluation table of five M. grosvenori samples

GC-MS分析發現D樣品中揮發性物質的含量最多，主成分分析發現D樣品揮發性物質分布較為密集，且多為醛、酮類物質。酮類物質具有一定的果香味，有研究表明一些酮類物質在低閾值時與醛類或其他物質存在相互作用，產生氣味增強或改變的現象[20]。通過嗅香進一步分析5個羅漢果樣品在感官品質上的差異性，結合表4可知，5個樣品嗅香各不相同，其中D樣品醇厚感較強，嗅覺層次較豐富，甜香、果香、膏香、藥草香明顯，感官品質最好。

3 結論

本實驗通過將羅漢果提取物與葡萄糖焦糖化料液摻配后進行不同溫度的加熱反應制備羅漢果香料，通過GC-MS分析發現D樣品(反應溫度為140 ℃)中揮發性物質的含量最多，B樣品(反應溫度為100 ℃)中揮發性物質的種類數最多。主成分分析發現主成分1、主成分2、主成分3的累計貢獻率達到90.520%，基本代表了樣品主要揮發性成分的組成,反映了原始變量的絕大部分信息,達到了降維目的。5個樣品根據距離遠近可分為3個區域，3個區域內樣品彼此間差異較大，A樣品與E樣品各自分為一個區域，B樣品、C樣品、D樣品彼此距離較近分為一個區域，表明B、C、D樣品的主成分差異較小。D樣品揮發性物質分布較為密集，對其特征香氣影響較大的香味物質主要包括2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、香草醛等，嗅香分析發現D樣品(反應溫度為140 ℃)中醇厚感較強，嗅覺層次較豐富，甜香、果香、膏香、藥草香明顯，感官品質最好。結合上述結果可認為反應溫度為140 ℃時得到的樣品具有最佳的風味和感官品質。