植物乳桿菌LBS8強化發酵腌制白蘿卜的條件優化研究

邊名鴻，鄒玉鋒，袁樂梅，許強，唐雪梅

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000)

白蘿卜為十字花科植物，含有粗纖維、芥子油和淀粉酶等有益物質，能助消化、止咳化痰，為食療佳品。腌制白蘿卜是我國傳統的發酵食品，深受人們喜愛。在傳統腌制過程中，因鹽含量高、技術不完善、產品質量不穩定等問題限制了腌制白蘿卜產業的發展[1]。

研究表明，以植物乳桿菌為發酵劑，強化發酵蔬菜能有效提高產品品質[2-3]。植物乳桿菌為同型發酵乳酸菌，能大量產酸，維持原料的pH，并且在發酵過程中能產生特有的乳酸桿菌素，起到維持腸道的菌群平衡、抑制腐敗菌和調節心血管等作用[4-6]。高世陽[7]利用植物乳桿菌接種榨菜發酵，接種發酵榨菜的各項指標優于自然發酵產品；汪立平等[8]將植物乳桿菌應用于低鹽蘿卜泡菜，比較了不同植物乳桿菌接種發酵與傳統發酵蘿卜的差異，結果證明接種植物乳桿菌能縮短泡菜發酵時間；朱珺等[9]從四川泡菜中篩選出一株具有益生特性的植物乳桿菌，研究表明其對胡蘿卜的口感有一定的改善作用并能顯著提高發酵中的活菌數；陳延等[10]將篩選出的功能乳酸菌進行復配發酵蕭山蘿卜干，發現接種乳酸菌能降低產品的pH和亞硝酸鹽含量，同時增加氨基酸態氮的含量等。然而，榨菜的感官特性不僅取決于原料，還取決于強化發酵劑的選擇，并對其發酵條件進行優化。強化發酵劑是腌制白蘿卜品質的一個重要影響因素，但很少有研究去探索強化發酵劑對腌制白蘿卜的影響。

本試驗將植物乳桿菌LBS8應用于白蘿卜強化發酵，比較接種乳酸桿菌LBS8和傳統發酵產品的差異。同時，通過監測發酵過程中總酸、乳酸菌數和氨基酸態氮含量的變化以及腌制成品的感官與理化分析，考察不同含鹽量、溫度、接種量和含水量對腌制白蘿卜品質的影響，優化發酵白蘿卜的發酵條件，以期為榨菜強化發酵劑的開發提供參考依據，同時為生產過程中的規范化、安全化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料與試劑

韓國白蘿卜、白菜：市售；植物乳桿菌LBS8：實驗室保藏；MRS培養基：北京陸橋技術股份有限公司；氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、甲醛、葡萄糖、酚酞、硫酸銅、亞甲藍、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、硼酸鈉、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、冰乙酸：均購自合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備

磁力攪拌器 艾測科技有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司；質構儀 英國Stable Micro System公司；冷凍干燥機 新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物乳桿菌種子液的制備

將植物乳桿菌接種于菜汁培養基，37 ℃恒溫培養，轉接3次，再以4000 r/min的速率離心處理15 min，用無菌生理鹽水清洗沉淀物，反復3次，制成菌濃度為1.0×109CFU/mL的發酵液。

1.2.2 白蘿卜腌制流程

1.2.2.1 傳統腌制白蘿卜工藝[11-13]

選料→剝菜→清洗→切塊→脫水(含水量30%)→加鹽(12%)→入壇發酵→封壇后熟→成品。

1.2.2.2 乳酸菌接種腌制白蘿卜發酵工藝

選料→剝菜→清洗→切塊→熱風烘脫水→加鹽腌制12 h→接菌(層層噴灑)→入壇發酵→封壇后熟→成品。

1.2.3 腌制白蘿卜發酵的單因素試驗

試驗選擇含鹽量、發酵溫度、接種量和含水量對腌制白蘿卜質量進行研究,單因素試驗因素水平設計見表1。基礎發酵條件：白蘿卜脫水至含水量為50%，用6%的鹽腌制白蘿卜12 h，接入6‰的植物乳桿菌發酵液，20 ℃培養20 d。當改變其中一個因素變量時，其他因素水平保持不變。

1.2.4 腌制白蘿卜工藝正交優化

根據單因素試驗結果可知，腌制白蘿卜受含鹽量(A)、發酵溫度(B)、接種量(C)和含水量(D)的影響均較大，選擇這4個因素進行四因素三水平的正交試驗，以感官評分、硬度、酸度、乳酸菌素、氨基酸態氮含量為評定指標，以腌制白蘿卜的綜合評分確定出最佳的低鹽腌制白蘿卜工藝[14-16]，正交試驗因素水平設計見表2。

表2 正交試驗因素水平設計表Table 2 Factors and leves of orthogonal experiment design

1.2.5 相關參數的分析方法

1.2.5.1 酸度

按照國標GB/T 12456—2008測定腌制白蘿卜的酸度，以乳酸計。

1.2.5.2 乳酸菌數

取25 g腌制白蘿卜，加入225 mL無菌生理鹽水，振蕩30 min后進行梯度稀釋，選擇2～3個適宜的稀釋樣液，涂布于2個無菌MRS平板上，于37 ℃恒溫培養2 d后進行菌落計數。

1.2.5.3 氨基酸態氮

按照國標GB 5009.235—2016中的酸度計法對腌制白蘿卜中的氨基酸態氮含量進行測定。

1.2.5.4 含水量

按照國標GB 5009.3—2016中的直接干燥法對白蘿卜的水分含量進行測定。

1.2.5.5 感官評定

采用百分制對腌制白蘿卜的色澤、香氣、質地、滋味這4大類12小類進行綜合評價，感官評定標準見表3。

表3 腌制白蘿卜感官品評標準Table 3 Sensory evaluation standards for pickled white radish

1.2.5.6 硬度測定

樣品處理為1 cm3的正方體。選用P/2探頭，圖像最高點的數值為腌制白蘿卜的硬度。測前速度2 mm/s，測中速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，壓縮比例為70%，每個樣品測定3次，取平均值。

1.2.5.7 綜合評分計算

將試驗的5個指標——總酸、乳酸菌數、氨基酸態氮含量、感官評分和硬度參照黃珊[17]的評價方法，運用隸屬度的綜合評分法，對其進行綜合評分。

1.2.5.8 抗氧化指標測定

參照Aurelia M P等[18]和Li M等[19]的研究方法，并稍作修改測定還原能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力。

1.2.6 數據分析方法

數據以平均數±標準差的形式表示。得到的數據使用SPSS進行ANOVA方差分析和鄧肯多重數據分析，在P<0.05(n=3)的條件下進行差異顯著性分析。利用Origin作圖，不同的英文字母表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 含鹽量對腌制白蘿卜的影響

圖1 不同含鹽量對腌制白蘿卜的影響Fig.1 Effect of different salt content on pickled white radish

圖2 不同含鹽量腌制白蘿卜硬度的影響Fig.2 Effect of different salt content on hardness of pickled white radish

含鹽量是腌制食品中的一個重要影響因素[20]。由圖1可知，隨著含鹽量的增加，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數隨之降低。乳酸菌可以抑制腐敗菌的滋生，賦予腌菜獨特的風味和提升腌菜的營養價值[21-22]。2%、4%和6%加鹽量產品的酸度和乳酸菌數差異較小，酸度在3.69～3.91 g/kg之間，乳酸菌數在8.86～10.7 log CFU/mL之間，且顯著大于傳統腌制產品。氨基酸態氮也隨著含鹽量的增加而減小，當含鹽量為6%時，感官評分最高，氨基酸態氮含量為0.048 g/100 g，超過6%時，下降速率增加，可能是由于鹽度過高導致腌制白蘿卜中的氨基酸態氮因滲透作用流出，被微生物利用。含鹽量為6%時，腌制白蘿卜的感官評分最高，硬度也高于傳統產品。

2.2 發酵溫度對腌制白蘿卜的影響

由圖3可知，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數隨著溫度的上升而增加，當發酵溫度超過15 ℃時，酸度增加較快，之后趨于平緩,維持在3.69～4.13 g/kg之間。乳酸菌數在20 ℃之后變化不大，維持在8.86～8.94 log CFU/mL之間。氨基酸態氮隨著發酵溫度的增加而增加，之后有所下降，原因可能是白蘿卜中的蛋白質被微生物分泌的蛋白酶降解為氨基酸等物質，因滲透作用流出而被微生物利用[23-24]。腌制白蘿卜的硬度隨著溫度的上升而增加，當溫度在25 ℃時，腌制白蘿卜的硬度達到了較高的水平，由于果膠甲酯酶的活性逐漸上升，果膠甲酯酶可將蔬菜中的高甲氧基果膠(HM)轉化成低甲氧基果膠(LM)，使 LM與鈣離子發生交聯作用，產生一種堅固的果膠酸鈣網絡來保持蔬菜的脆度[25]。腌制白蘿卜在發酵溫度為20 ℃時的感官評分最高，但與25 ℃溫度發酵的產品相差較小，分別為93.3分和91.3分，且25 ℃的腌制白蘿卜硬度較高。綜合考慮，以25 ℃為最佳發酵溫度。

圖3 不同發酵溫度對腌制白蘿卜的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperatures on pickled white radish

圖4 不同發酵溫度對腌制白蘿卜硬度的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperatures on hardness of pickled white radish

2.3 接種量對腌制白蘿卜的影響

圖5 不同接種量對腌制白蘿卜的影響Fig.5 Effect of different inoculation amount on pickled white radish

圖6 不同接種量對腌制白蘿卜硬度的影響Fig.6 Effect of different inoculation amount on hardness of pickled radish

由圖5可知，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數隨著接種量的增加而增加，當接種量超過8‰時，酸度及乳酸菌數趨于平緩，但氨基酸態氮卻在上升，游離的氨基酸態氮增多，發酵產品的風味和營養價值隨之增高。接種量為6‰時感官評分最高，為93.3分，但相較于10‰接種量的感官評分差異較小，為91.9分。此外，接種量超過4‰時，菜皮和菜心的硬度下降，原因可能是酸度過高，導致其生成的果膠酸減少，相應生成的果膠酸鈣降低[26],但發酵產品菜心的硬度都高于傳統產品。因此，植物乳桿菌強化白蘿卜發酵，有利于腌制白蘿卜硬度的保持。綜合考慮，以10‰為最佳接種量。

2.4 含水量對腌制白蘿卜的影響

圖7 不同含水量對腌制白蘿卜影響Fig.7 Effect of different water content on pickled white radish

圖8 不同含水量的腌制白蘿卜硬度的影響Fig.8 Effect of different water content on hardness of pickled white radish

由圖7可知，隨著含水量的增加，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數隨之增加。當含水量超過50%時，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數趨于平穩，分別維持在3.69～3.96 g/kg和8.86～8.96 log CFU/mL之間。當含水量小于50%時，腌制白蘿卜的感官評分隨著含水量的增加而增加，但超過50%后，感官評分下降。隨著含水量的增加，氨基酸態氮含量也在增加，且當含水量超過50%后，其含量增加明顯。原因可能是白蘿卜在脫水過程中產生應激反應，與丙氨酸、脯氨酸、GABA和谷氨酸代謝相關的酶活性在脫水過程中保持其活性，在制備過程中積累了丙氨酸、脯氨酸和GABA等氨基酸，且具有良好的口感和保健作用[27]。綜合考慮，以含水量50%為最佳含水量。

2.5 腌制白蘿卜工藝的正交試驗優化結果

分別對4個因素：含鹽量(A)、發酵溫度(B)、接種量(C)和含水量(D)進行單因素試驗的基礎上，進一步探討各因素對腌制白蘿卜的協同影響，以腌制白蘿卜產品的綜合評分為指標，優化腌制白蘿卜工藝。試驗各指標數據見表4～表6。

表4 正交試驗優化結果Table 4 Results of orthogonal experiment optimization

表5 各指標下的正交試驗數據表Table 5 Orthogonal experiment data under each index

表6 各指標下正交試驗的隸屬度和綜合評分表Table 6 Membership degree and comprehensive scores of orthogonal experiment under each index

由表4中的極差R值可知，影響綜合評分的因素為A>C>D>B，即含鹽量>接種量>含水量>發酵溫度；其最佳工藝條件為A2B3C1D1，即含鹽量6%，發酵溫度27 ℃，接種量9‰，含水量45%。

2.6 傳統與強化發酵白蘿卜質量評價對比分析

表7 不同發酵方式腌制白蘿卜的評價指標值Table 7 Evaluation index values of pickled white radish by different fermentation methods

由表7可知，最佳工藝條件下腌制白蘿卜的酸度、乳酸菌數、氨基酸態氮、感官評分、菜皮和菜心硬度顯著高于傳統自然發酵產品，亞硝酸鹽含量低于傳統自然發酵產品。最佳工藝產品的還原能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力均顯著高于傳統自然發酵產品。本試驗最佳工藝產品的抗氧化性與武晉海等的無預腌漬產品的抗氧化性相同[28]。在此發酵工藝下，腌制白蘿卜酸度適中，硬度較好，有腌制白蘿卜特有的琥珀色和香味，綜合品質較好。初步說明功能菌LBS8強化發酵在保證腌制白蘿卜感官品質的前提下，具有一定的降解產品中亞硝酸鹽和提高產品抗氧化能力的作用。

3 結論

綜上所述，以植物乳桿菌LBS8強化發酵腌制白蘿卜對其品質影響較大，通過接種強化發酵劑發酵白蘿卜較自然發酵能有效提升其產品質量，不論是硬度還是感官評分都顯著提升。研究發現，含鹽量、發酵溫度、接種量和含水量對腌制白蘿卜的品質均有影響，并通過單因素試驗及正交試驗，得出植物乳桿菌LBS8強化發酵白蘿卜的最佳發酵條件為：含鹽量6%，發酵溫度27 ℃，接種量9‰，含水量45%。在該條件下發酵的腌制白蘿卜酸度適中，硬度較好，有腌制白蘿卜特有的琥珀色和香味，綜合品質較好。酸度、乳酸菌數、氨基酸態氮含量、感官評分、菜皮硬度、菜心硬度顯著高于傳統自然發酵產品；亞硝酸鹽含量為0.20 mg/kg，顯著低于傳統自然發酵產品；還原能力為119.28 μmol/L，羥自由基清除能力為39.46%，超氧陰離子自由基清除能力為78.74%，DPPH自由基清除能力為40.12%，均顯著高于傳統自然發酵產品。本研究為微生物強化發酵腌制蔬菜食品提供了一定的數據參考，為提高傳統腌制蔬菜食品的穩定性及工業化、標準化生產提供了一定思路。