三種產(chǎn)地柿子醋揮發(fā)性物質(zhì)和有機(jī)酸成分分析

韓妍，仲美橋，史玉，黃一承，李曉磊，李丹

(長春大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工吉林省普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130022)

柿子(DiospyroskakiThunb.)又名長生果，主要分布在河北、山東和陜西等氣候溫暖、陽光充裕的地方。柿子富含糖類、蛋白質(zhì)和粗纖維等物質(zhì)，具有潤肺養(yǎng)肺、健脾健胃的功效，味道香甜，口感清脆，深受國人的喜愛[1-2]。

食醋是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾恼{(diào)味品之一。中國傳統(tǒng)食醋多以高粱、糯米、大米、麩皮等谷物為原料，通過液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵而制成。食醋可以增強(qiáng)食欲，促進(jìn)消化。但食醋內(nèi)蛋白質(zhì)、纖維等含量較少，且風(fēng)味單一[3]，所以果醋等越來越受到消費(fèi)者的青睞。

柿子醋是在食醋的釀造基礎(chǔ)上，以柿子原漿為原料，通過釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)發(fā)酵后接種醋酸菌(Acetobacteraceti)，最后完成醋酸發(fā)酵而成，其發(fā)酵過程中既保留了傳統(tǒng)醋的風(fēng)味，又增添了柿子特殊的果香。柿子醋具有增強(qiáng)食欲，調(diào)節(jié)人體pH值，補(bǔ)益氣血，美容養(yǎng)顏等功效，逐漸成為研究的熱點(diǎn)[4—6]。

柿子醋憑特殊的果香風(fēng)味和較高的營養(yǎng)價值、保健功效深受消費(fèi)者的青睞，但是關(guān)于柿子醋香味成分的分析研究匱乏。頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和高效液相色譜技術(shù)是風(fēng)味研究常用的技術(shù)[7-8]。本研究應(yīng)用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和高效液相色譜技術(shù)對3種不同產(chǎn)地柿子醋的揮發(fā)性物質(zhì)和有機(jī)酸組成及含量進(jìn)行分析檢測，通過層次聚類分析和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析處理，并研究了3種柿子醋的OAV值，為柿子醋的檢測和品質(zhì)評價提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市場購買的3種不同產(chǎn)地的柿子醋，分別為山西運(yùn)城(醋A液態(tài)發(fā)酵)；河南洛陽(醋B液態(tài)發(fā)酵)；河南欒川(醋C固態(tài)發(fā)酵)；氯化鈉(分析純)：上海Aladdin公司；亞鐵氰化鉀(分析純)：沈陽試劑三廠；硫酸鋅(分析純)：北京化工廠；乙酸、乳酸、蘋果酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸和馬來酸標(biāo)準(zhǔn)品：均為色譜純，美國Sigma公司。

0.22 μm疏水式針式過濾器 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；頂空進(jìn)樣瓶(15 mL)、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭 美國Supelco公司；DB-5MS UI毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國Agilent公司；Acclaim OA色譜柱(4.0 mm×250 mm×5 μm) 美國ThermoFisher Scientific公司；QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本Shimadzu公司；Centrifuge 5430離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Summit P680高效液相色譜儀 德國Dionex公司。

1.2 方法

1.2.1 HS-SPME-GC-MS分析

取0.50 mL柿子醋樣品、1.50 mL蒸餾水和1.00 g氯化鈉于15 mL頂空瓶中，加入10 μL 200 mg/L的2-辛醇溶液作為內(nèi)標(biāo)，并加入磁力攪拌子，密封置于200 r/min的磁力攪拌器上，每次萃取前50 ℃預(yù)平衡10 min。

HS-SPME條件：用已老化好的萃取頭頂空吸附30 min，然后將萃取頭拔出頂空瓶并迅速插入GC進(jìn)樣口解吸5 min，同時啟動升溫程序。

GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比為1∶10，5 min后吹掃流量20 mL/min；載氣為He，柱流量1.0 mL/min；程序升溫條件：初始柱溫40 ℃，保持5 min，以6 ℃/min的速率升至100 ℃/min，保持1 min；以5 ℃/min的速率升至190 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升至230 ℃，保持1 min。

MS條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃；GC-MS接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍(m/z)35～600，全掃描模式。

定性方法：通過質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)信息庫NIST 16進(jìn)行檢索比對，并對C6-C30正構(gòu)烷烴混合標(biāo)樣進(jìn)行色譜掃描，計(jì)算香氣成分的保留指數(shù)，并與相應(yīng)文獻(xiàn)值進(jìn)行對照。保留指數(shù)按下式計(jì)算:

式中：Z為目標(biāo)化合物流出前的正構(gòu)烷烴所含碳原子數(shù)；N為目標(biāo)香氣物質(zhì)左側(cè)正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；tRa、tRN、tR(N+1)分別為待測香氣物質(zhì)、待測香氣物質(zhì)左側(cè)和右側(cè)正構(gòu)烷烴的保留時間(min)。

定量方法：以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物，通過SIM方法定量化合物含量。

1.2.2 OAV值計(jì)算

OAV法：查閱揮發(fā)性成分在水中的閾值，根據(jù)每種香氣成分的質(zhì)量濃度與閾值的比值計(jì)算其OAV，以此評價該香氣成分對樣品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度[9-11]。其中，OAV≥1的物質(zhì)為特征香氣成分。OAV按下式計(jì)算：

式中：Ci為香氣成分的質(zhì)量濃度(μg/mL)；OTi為香氣成分在水中的閾值(mg/L)。

1.2.3 有機(jī)酸含量測定

分別準(zhǔn)確稱取一定量的草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、順丁烯二酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相配制成10，20，5，20，10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依次稀釋成 0.830，1.670，0.520，1.670，0.280 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于進(jìn)樣分析。

取5 mL樣品，用蒸餾水定容至50 mL，置于6000 r/min的離心機(jī)離心6 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待測。

HPLC條件：流動相100 mmol/L Na2SO4(pH 2.65)；檢測波長UV 210 nm；流速0.50 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

采用單點(diǎn)校正法進(jìn)行定量分析。按下式計(jì)算：

式中：X為有機(jī)酸樣品的質(zhì)量濃度(mg/g)；A為測得有機(jī)酸樣品的峰面積；A0為測得有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；C為有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(mg/g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Office Excel 2016 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理計(jì)算，通過TBtools進(jìn)行層次聚類分析以及熱圖制作，采用SIMCA進(jìn)行OPLS-DA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種不同產(chǎn)地柿子醋揮發(fā)性成分HS-SPME-GC-MS分析

表1 3種柿子醋樣品中揮發(fā)性物質(zhì)分析結(jié)果

續(xù) 表

將提取得到的柿子醋揮發(fā)性成分質(zhì)譜圖與NIST 11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，將相似度超過 80%的組分保留。由表1可知，在3種不同產(chǎn)地的柿子醋中共鑒定出36種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類14種、醇類8種、醛類7種、酮類4種、酚類2種、酸類1種。這些化合物共同構(gòu)成了柿子醋的獨(dú)特風(fēng)味，可以發(fā)現(xiàn)不同柿子醋中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)種類和數(shù)目具有差異，柿子醋揮發(fā)性物質(zhì)不同可能是因?yàn)樯a(chǎn)過程中的發(fā)酵工藝不同，不同產(chǎn)地的柿子香氣成分也不同。

酯類物質(zhì)是在柿子醋的發(fā)酵過程中，柿子中的有機(jī)酸和醇類物質(zhì)發(fā)生了酯化反應(yīng)，在微生物的代謝過程中氨基酸發(fā)生脫氨、脫羧而生成[12]。研究資料表明[13]，酯類化合物不僅對食醋的香氣貢獻(xiàn)了重要作用，還是食醋中有效物質(zhì)最多的一項(xiàng)，這與本研究結(jié)果基本一致。在3種不同產(chǎn)地的柿子醋中，共鑒定出酯類化合物14種，乙酸苯乙酯是3種柿子醋的共有成分，其中醋A的含量最高，為736.46 μg/L，醋B和醋C中乙酸苯乙酯含量分別為9.42 μg/L和73.66 μg/L，乙酸苯乙酯具有微甜的香味和玫瑰花香，又帶有蘋果的果香和威士忌樣的香韻[14]。乙酸苯乙酯還可用于治療急慢性黃疸型肝炎和膽囊炎等疾病[15]。醋C中乙酸乙酯含量為386.07 μg/L，乙酸乙酯具有淡淡的果香和酒香，擴(kuò)散速度快。

醇類化合物主要來自柿子醋的發(fā)酵階段，包括有氧環(huán)境下柿子中的糖類轉(zhuǎn)化、無氧條件下柿子中的氨基酸轉(zhuǎn)化及相應(yīng)的醛類化合物被微生物還原而生成。從3種不同產(chǎn)地的柿子醋中，共鑒定出8種醇類物質(zhì)，其中醋C中醇類物質(zhì)最多，含量為1005.11 μg/L，2-乙基己醇是3種柿子醋的共同風(fēng)味物質(zhì)，2-乙基己醇是香料中的香氣物質(zhì)。3種醋中含量較高的還有2,3-丁二醇和苯乙醇等。苯乙醇主要由苯丙氨酸經(jīng)Strecker降解產(chǎn)生醛后進(jìn)一步還原而生成，具有甜甜的玫瑰花香，其中醋C中苯乙醇的含量最高，達(dá)到了223.49 μg/L。

醛類化合物主要是在柿子醋的發(fā)酵過程中酯類氧化和降解反應(yīng)產(chǎn)生的，Strecker降解反應(yīng)也是其重要來源之一。在食醋的釀造過程中醛類化合物貢獻(xiàn)了淡淡的焦香氣味[16]。在3種不同產(chǎn)地的柿子醋中，鑒定出醛類物質(zhì)共7種，其中含量最高的是3-糠醛，醋C中含量高達(dá)445.32 μg/L，醋B中含量為97.32 μg/L，其次是反式肉桂醛和3-甲氧基苯甲醛，醋C中含量分別為426.16 μg/L和177.06 μg/L。在3種柿子醋的醛類化合物比對中，醋C的醛類化合物含量最高，為1146.93 μg/L，其次是醋B中含量，為111.43 μg/L。

酮類化合物也是脂肪氧化和降解的產(chǎn)物之一，酮類化合物還是形成雜環(huán)類化合物的中間體。在3種柿子醋中，檢測出2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、仲辛酮、1,3,3-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-酮共4種酮類化合物，根據(jù)文獻(xiàn)[17]，2,3-丁二酮和3-羥基-2-丁酮是食醋中常見的揮發(fā)性物質(zhì)，2,3-丁二酮主要是發(fā)酵過程中的微生物，由乳酸和酵母代謝而產(chǎn)生，具有淡淡的奶香。此外，2,3-丁二酮和3-羥基-2-丁酮可以相互轉(zhuǎn)化。

2.2 3種柿子醋揮發(fā)性成分層次聚類分析及正交偏最小二乘判別分析

圖1 3種柿子醋揮發(fā)性成分聚類熱圖Fig.1 Cluster heat map of volatile components in three kinds of persimmon vinegar

圖2 3種柿子醋香氣物質(zhì)OPLS-DA的分?jǐn)?shù)散點(diǎn)情況Fig.2 Scores plot of OPLS-DA model of aroma substances in three kinds of persimmon vinegar

為了對3種不同產(chǎn)地柿子醋中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行研究，針對其含量進(jìn)行了層次聚類分析，可以看到不同產(chǎn)地柿子醋中36種揮發(fā)性物質(zhì)的分布規(guī)律。由圖1可知，相對含量的高低由顏色的深淺決定，相對含量越高紅色越深，相對含量越低藍(lán)色越深[18-19]。

對圖1進(jìn)行縱向分析，可將柿子醋中的香氣成分分為4個類別，分別為 I(苯甲醛～2,3-丁二醇)、II(2,4-二叔丁基苯酚～3-糠醛)、III(乙酸苯乙酯～2-甲基丁基乙酸酯)和 IV(苯甲酸～乙酸芐酯)。I類中主要是酯類和醇類物質(zhì)，乙酸乙酯和苯乙醇為主要揮發(fā)性物質(zhì)。在3種不同柿子醋中，醋C的乙酸乙酯和苯乙醇含量最高，乙酸乙酯微帶果香和酒香，而苯乙醇具有清甜的玫瑰花香；II類中主要是醛類物質(zhì)，主要是由柿子中的糖分在酸的作用下水解生成戊糖再經(jīng)過脫水形成的，具有焦糖味；III類中主要物質(zhì)是酯類物質(zhì)，其中乙酸乙酯和乙酸苯乙酯含量較高，乙酸苯乙酯具有淡淡的玫瑰花香，這是柿子醋獨(dú)特的味道之一；IV類中主要是苯甲酸，苯甲酸可以有效地抑制微生物細(xì)胞內(nèi)呼吸酶系的活性，起到很好的防腐作用[20]。

通過OPLS-DA模型進(jìn)一步分析3種柿子醋的差異。在OPLS-DA模型中R2X和R2Y代表模型對X和Y矩陣的解釋能力，Q2表示模型的預(yù)測能力[21]。由圖2可知，模型中R2X=0.986，R2Y=0.992，Q2=0.986，其中R2X=0.986表明該模型能反映98.6%數(shù)據(jù)的變化，R2和Q2均大于0.9，表明該模型具有較高的可解釋度和預(yù)測能力。3種柿子醋樣品在得分圖上聚類良好，組內(nèi)差異性小，3種樣品之間完全分離，存在一定差異性。

2.3 OAV分析

柿子醋的整體風(fēng)味取決于不同香氣物質(zhì)的濃度，同時與物質(zhì)的察覺閾值密不可分，不同產(chǎn)地的柿子醋有其獨(dú)特的風(fēng)味。由于不同香氣物質(zhì)的特征及閾值不同，對風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)也存在差異，通過OAV進(jìn)一步分析揮發(fā)性香氣的作用，所用閾值參考《化合物香味閾值匯編(第二版)》[22]及文獻(xiàn)[23-24]。OAV≥1能被嗅覺感官所感知，OAV<1通常起到修飾味道的作用，但由于不同化合物間可能存在如協(xié)同、加成及掩蓋等作用的相互影響。因此，對所有OAV>0.01的香氣化合物均予以列出，見表2。3 種柿子醋中共有3種化合物的OAV>1，可能是主要呈香物質(zhì)，按照揮發(fā)性風(fēng)味特征，將3種柿子醋的香氣分成2個系列，分別是蘋果香和玫瑰香。

表2 3種柿子醋中香氣物質(zhì)OAV值Table 2 OAV values of aroma substances in three kinds of persimmon vinegar

續(xù) 表

2.4 HPLC分析有機(jī)酸含量

對3種不同產(chǎn)地柿子醋的有機(jī)酸含量進(jìn)行分析，與標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸混合溶液進(jìn)行對照，醋A中有2種有機(jī)酸，醋B中有3種有機(jī)酸，醋C中有5種有機(jī)酸，見表3。

表3 3種柿子醋中有機(jī)酸含量

有機(jī)酸物質(zhì)是食醋最重要的成分之一，賦予食醋特定的風(fēng)味和感官屬性。3種不同產(chǎn)地的柿子醋中均含有大量的醋酸。其中醋A中含量為37.7 mg/mL，醋B中含量為30.35 mg/mL，醋C中含量為13.35 mg/mL，而醋B中和醋C中檸檬酸的含量存在顯著差異，其含量分別為 0.12 mg/mL和19.47 mg/mL，檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，有很強(qiáng)的酸味，易溶于水，是天然的防腐劑[25]。醋C中還含有酒石酸，酒石酸是一種天然的抗氧化劑，具有香甜的酸味[26]。其他酸類如乳酸和草酸等含量較少，但也對柿子醋的風(fēng)味做出貢獻(xiàn)。3種柿子醋中不揮發(fā)性酸的種類和含量不同，與生產(chǎn)過程中不同的原料和不同的發(fā)酵工藝有關(guān)，這些有機(jī)酸共同影響了柿子醋的酸味質(zhì)量。

2.5 有機(jī)酸含量、閾值、TAV值及風(fēng)味特征描述

3種不同產(chǎn)地柿子醋的5種有機(jī)酸含量見表4。

表4 3種柿子醋的有機(jī)酸濃度、閾值、TAV值及風(fēng)味特征描述Table 4 Description of organic acid concentration, threshold values, TAV values and flavor characteristics of three kinds of persimmon vinegar

續(xù) 表

由表4可知，醋C中的檸檬酸和乳酸含量較高，分別為486.75 mg/mL和588.95 mg/mL。參考文獻(xiàn)[27-28], 檸檬酸和乳酸共有特征風(fēng)味略有澀感，這可能與柿子的表皮呈味略澀的緣故有關(guān)。根據(jù)研究表明，有機(jī)酸的含量和成分在調(diào)整時添加的酸和發(fā)酵的過程中酵母菌代謝產(chǎn)生酸有密切關(guān)系。

為探究風(fēng)味中有機(jī)酸的影響，TAV可作為探究揮發(fā)性香氣成分在食品基質(zhì)中的貢獻(xiàn)，TAV是更精準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，TAV>1的物質(zhì)對該樣品呈現(xiàn)出的整體香氣有貢獻(xiàn)[29]。因此，根據(jù)TAV值對香味成分的分析進(jìn)行了綜合評價。3種柿子醋中的醋酸的TAV值特別高，這也是醋聞起來特別酸的緣故；除醋酸外，醋C中5種有機(jī)酸的TAV值均大于醋A和醋B，并且大于1，這也是醋C的整體風(fēng)味豐富的緣故。

為進(jìn)一步分析主要的風(fēng)味特征，對其TAV值大于1的有機(jī)酸進(jìn)行香氣輪分析，見圖3。其中醋A和醋B的主要風(fēng)味特征是酸味呈刺激性，而醋C略帶有微弱的香氣，呈味略澀，略酸。

圖3 3種柿子醋的有機(jī)酸香氣輪圖Fig.3 The aroma wheel diagram of organic acids in three kinds of persimmon vinegar

3 結(jié)論

通過HS-SPME結(jié)合GC-MS從3種不同產(chǎn)地的柿子醋中鑒定出36種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類、醇類和醛類含量最高，分別檢測出14種、8種和7種。醋A酯類含量最高，為1205.87 μg/L；醋C醇類和醛類含量最高，分別為1005.11 μg/L和1146.93 μg/L。酯類物質(zhì)中乙酸苯乙酯是3種柿子醋的共有成分，含量分別為736.46，9.42，73.66 μg/L；醇類化合物中2-乙基己醇是3種柿子醋的共同風(fēng)味物質(zhì)，含量分別為87.93，97.56，88.88 μg/L。

通過層次聚類分析及OPLS-DA進(jìn)一步分析3種柿子醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)3種柿子醋間香氣物質(zhì)含量存在差異。根據(jù)香氣物質(zhì)的OAV值，乙酸異戊酯、2-甲基丁基乙酸酯和乙酸苯乙酯是醋A中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，乙酸異戊酯是醋B中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物。

柿子醋的有機(jī)酸測定結(jié)果表明，3種柿子醋中醋酸的含量最高且不同產(chǎn)地醋中醋酸含量存在明顯的差異，3種柿子醋的醋酸含量分別為37.7，30.35，13.35 mg/mL。根據(jù)有機(jī)酸的TAV值，檸檬酸和乳酸對柿子醋的風(fēng)味起到了重要的作用。