固態發酵黑姜揮發性物質的GC-MS測定

王麗媛，周寧，寧月寶

(內蒙古科技大學 生命科學與技術學院，內蒙古 包頭 014010)

生姜是一種藥食同源的植物，在很多地區作為一種常用的烹飪調味品，用來去除食物中的膻腥味，增加鮮味，提高食物風味[1-2]。生姜主要的活性成分是姜辣素，除此之外，還含有多種功能性物質，如姜烯酚和姜酮等酚類物質、嘌呤類化合物、抗氧化酶、姜油及多糖類、糖蛋白和黃酮類物質[3-4]。生姜中含量最高的姜酚是姜辣素，其中大部分是6-姜辣素，其含量占總姜辣素的75%左右[5]。生姜具有抗腫瘤[6-7]、抗炎[8]、抗氧化[9-10]、保護心血管[11-12]、抗骨關節炎[13]以及抑制癌細胞活性等作用。生姜中的8-姜酚和10-姜酚對各種腫瘤細胞的活性都具有很好的抑制作用[14]。

生姜通過恒溫恒濕箱按照規定的條件(溫度(68.0±1.0) ℃，濕度(95.0±1.0))，發酵30 d得到一種黑色物質，稱為發酵黑姜[15]。發酵黑姜的營養成分顯著升高，辛辣氣味減少，是一種天然健康的保健食品[16]。發酵過程主要發生了美拉德反應[17]。本實驗采用同時蒸餾萃取法分別提取發酵黑姜與烘干姜中的揮發性成分并進行對比分析，通過GC-MS分析，確定了發酵黑姜與烘干姜的化學組成和相對百分含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

新鮮生姜：購自包頭市昆都侖區友誼菜市場；昆明種小鼠：購自內蒙古大學實驗動物中心。

1.1.2 試劑

二氯甲烷(CH2Cl2)、氯化鈉(NaCl)、無水硫酸鈉(Na2SO4)：國產分析純，天津市風船化學試劑三廠；四氧嘧啶(C4H2N2O4)：浙江中科瑞泰生物科技有限公司。

1.1.3 儀器

FA2104B型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；FTT-800C型多功能粉碎機 東莞市房太電器有限公司；QYZL-6B型同時蒸餾萃取裝置 上海喬躍電子科技有限公司；DZKW型恒溫水浴鍋 余姚市亞星儀器儀表有限公司；KDM500型控溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；RE52CS-2型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；Agilent 7890A-5975C GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；YZB/湘 0043-2012血糖儀 三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生姜的發酵

將恒溫恒濕箱的濕度調在95%，溫度控制在68 ℃，再把新鮮生姜放入恒溫恒濕箱中，發酵30 d后生姜發生美拉德反應顏色變黑，辛辣氣味揮發消失，得到發酵黑姜。

1.2.2 發酵黑姜的揮發物提取(SDE法)

操作SDE之前，在同時蒸餾萃取裝置的兩端同時加入二氯甲烷(30 mL)和超純水(350 mL)蒸餾2 h，清洗同時蒸餾萃取裝置以保證儀器潔凈。將發酵黑姜和烘干姜干燥好后用粉碎機打成粉末，分別稱取發酵黑姜和烘干姜樣品30 g(精確至1 mg)后把樣品放入燒杯中，加入適量的超純水和氯化鈉(NaCl分析純)溶解后把溶液倒入1000 mL的圓底燒瓶中，加入適量的沸石和超純水，再接上同時蒸餾萃取儀的一端用控溫電熱套加熱至微沸。取出圓底燒瓶(50 mL)，里面加入一些沸石和二氯甲烷(30 mL)，浸泡在恒溫水浴鍋(55 ℃)中，連續蒸餾萃取2 h。為保證實驗的精準性，滴下溶劑的速度控制在5 s/滴左右。萃取完成后，把同時蒸餾萃取儀冷卻至室溫后再把儀器拆開，并把儀器中的有機溶劑和燒瓶中的萃取液合并到一起。在低溫冰柜(條件：-40 ℃)中冷凍過夜，再把殘留的水用無水硫酸鈉(Na2SO4分析純)除去，把溶劑用旋轉蒸發儀揮發，最后把提取物濃縮至1 mL(放入色譜瓶)進行GC-MS分析[18]。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：He，1.0 mL/min；升溫程序：柱初始溫度為50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min的速率升溫至220 ℃；進樣口的溫度為250 ℃；進樣方式：分流進樣，分流比是4∶1；進樣量是1 μL。

質譜條件：EI離子源，電子能量70 eV；電子倍增器電壓1635 V；質量掃描范圍30～450 amu，離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度240 ℃；四極桿溫度150 ℃。

1.2.4 姜辣素對小鼠的降血糖作用

將小鼠隨機分成兩組，對照組10只，實驗組20只，稱平均體重。給實驗組小鼠的腹腔注射20 mg/kg的四氧嘧啶溶液，建立小鼠糖尿病模型。對照組的小鼠注射同等劑量的生理鹽水。通過血糖儀檢測小鼠的血糖濃度，將高于7.0 mmol/L 的小鼠歸為高血糖小鼠，高血糖小鼠按照血糖高低再分為中高血糖組(13.78 mmol/L)和高血糖組(27.97 mmol/L)兩組。用黑姜姜辣素給實驗組小鼠連續灌胃28 d，給姜辣素400 mg/kg，在給小鼠灌胃的第14天和第28天，禁食12 h以后，測量其血糖值。

2 結果分析

2.1 同時蒸餾萃取法發酵黑姜的測定結果

發酵黑姜中揮發性成分的GC-MS總離子流圖見圖1。使用專業分析軟件(Shimadzu GC-MS solution Release 2.10)對總離子流進行分析，分析結果得到361種化合物。化合物各組中的相對峰要按照面積歸一法計算百分比含量[19]。根據所得到的質譜信息可鑒定成分，使用譜庫檢索數據實行檢索。通過與標準圖譜相對比，進行化學結構的確認。其中鑒定出了16種化合物，占總含量的27.81%。

圖1 發酵黑姜中揮發性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components in fermented black ginger

通過對發酵黑姜揮發性物質的化學成分進行GC-MS分析鑒定出了姜辣素，主要相對總含量：β-紅沒藥烯(12.89%)和金合歡烯(11.57%)，見表1。其中還鑒定出了22種硫醚類化合物，其中硫醚類化合物總含量為0.24%，硫醚類化合物見表2。

表1 發酵黑姜中揮發性成分鑒定結果Table 1 Identification results of volatile components in fermented black ginger

表2 發酵黑姜揮發性物質中含有的硫醚類化合物Table 2 Thioether compounds contained in volatile substances of fermented black ginger

續 表

2.2 同時蒸餾萃取法烘干姜的測定結果

烘干姜中揮發性物質的總離子流圖見圖2。

圖2 烘干姜中揮發性成分的總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of volatile components in dried ginger

通過對烘干姜揮發性物質的化學成分進行GC-MS分析，鑒定出了14種化合物，占總含量的24.23%。其揮發性成分主要由β-紅沒藥烯(6.3%)和β-姜黃素(3.95%)組成，其相對總含量為10.25%，見表3。其中還鑒定出了7種硫醚類化合物，其中硫醚類化合物總含量為0.24%，見表4。

表3 烘干姜中揮發性成分鑒定結果Table 3 Identification results of volatile components in dried ginger

表4 烘干姜揮發性物質中含有的硫醚類化合物Table 4 Thioether compounds contained in volatile substances of dried ginger

續 表

為了更直觀地對發酵黑姜與烘干姜做對比，現將發酵黑姜與烘干姜主要揮發性物質進行對比總結，結果見表5。

表5 發酵黑姜與烘干姜主要揮發性物質對比Table 5 Comparison of main volatile compounds between fermented black ginger and dried ginger %

2.3 姜辣素對小鼠降血糖作用的測定結果

高血糖組小鼠灌胃后血糖值與灌胃前相比，血糖下降率為71%，中高血糖值組小鼠灌胃后血糖值與灌胃前相比，血糖下降率為52.44%。結果表明，黑姜姜辣素對小鼠具有很好的降血糖作用(見表6)。

表6 黑姜姜辣素對小鼠血糖的影響Table 6 Effect of gingerol in black ginger on blood glucose of mice

3 結論

以上數據結果顯示，發酵黑姜的揮發性成分中β-紅沒藥烯為12.89%，金合歡烯為11.57%，這兩種成分都屬于姜辣素，而烘干姜的揮發性成分中β-紅沒藥烯僅為6.3%，且并沒有發現金合歡烯的存在。經過GC-MS分析結果發現，發酵黑姜的姜辣素中β-紅沒藥烯比烘干姜中含有的β-紅沒藥烯提高了2.04倍，發酵黑姜的姜辣素比烘干姜的姜辣素提高了3.88倍，發酵黑姜的姜辣素含量明顯升高，并且通過實驗發現，姜辣素可以顯著降低小鼠的血糖值，因此，發酵黑姜的降血糖效果比烘干姜的降血糖效果更顯著。