粘質沙雷氏菌高產發酵靈菌紅素的工藝優化及抗病毒活性

葛 明，馮 佳，李 瑩，焦裕冰，申莉莉，王鳳龍，李 斌，李文剛，劉東陽，王 勇，江連強，張明金，閆芳芳，楊 宇*，楊金廣*

粘質沙雷氏菌高產發酵靈菌紅素的工藝優化及抗病毒活性

葛 明1，馮 佳1，李 瑩1，焦裕冰1，申莉莉1，王鳳龍1，李 斌2，李文剛2，劉東陽3，王 勇3，江連強3，張明金4，閆芳芳5，楊 宇5*，楊金廣1*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.四川省煙草公司，成都 610017；3.四川省煙草公司涼山州公司，四川 西昌 615000；4.四川省煙草公司瀘州市公司，四川 瀘州 646000；5.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617000）

為提高粘質沙雷氏菌S3菌株的靈菌紅素產率，本研究對粘質沙雷氏菌S3發酵過程中重要的發酵條件參數和關鍵組分進行逐項優化，并驗證了發酵液靈菌紅素提取物對本氏煙草病毒的抑制效果。結果表明，最佳培養基配方為：丙三醇0.5%，蛋白胨1.5%，氯化鈉0.5%，氯化鉀0.25%；最佳發酵條件為：接種量為10%，裝液量為60%～70%，pH恒定為6.0，培養溫度為28 ℃，振搖速度160 r/min，發酵周期為60 h。在該發酵條件下，既有利于粘質沙雷氏菌菌體生長，又能夠使靈菌紅素的產量達到最大化。按照該優化條件進行發酵后，其靈菌紅素提取物溶液噴施于接種TMV、CMV和PVY的本氏煙，煙葉中TMV、CMV和PVY病毒量分別為空白對照的12.61%、29.41%和17.69%，對病毒的抑制效果優于氨基寡糖素。試驗所得的發酵制備條件能夠提高靈菌紅素產量，提取物具備顯著抗病毒特性，具有產業化開發潛力和經濟應用價值。

粘質沙雷氏菌；靈菌紅素；發酵條件優化；植物抗病毒劑

靈菌紅素（Prodigiosin）是由粘質沙雷氏菌（）及其他多種細菌產生的一種天然次生代謝產物，其中粘質沙雷氏菌產生的靈菌紅素的生物活性較好[1]。靈菌紅素具有3個吡咯組成的甲氧基吡咯骨架，幾乎不溶于水，但易溶于極性較大的有機溶劑，在不同pH條件下呈現不同的顏色[2]。近年來研究表明，靈菌紅素在抗細菌[3]、抗病毒[4]、抗真菌[5]、免疫調控[6]以及純天然工業染料[7]等方面具有廣闊的應用潛力。本實驗室已初步揭示了靈菌紅素可以誘導寄主植物產生抗病毒特性[8]，激活農作物抗病毒免疫調控。

目前，靈菌紅素可以通過化學合成法[5]和微生物發酵法[9]制備。然而化學合成法相對困難，反應步驟復雜，產率低，難以實現大規模生產；而目前國內對靈菌紅素發酵過程的研究主要使用搖瓶培養，對發酵罐發酵過程研究較少[10]。在發酵過程中，次級代謝產物的合成不僅受制于碳氮源的快速消耗及其分解產物的積累[11]，還受磷酸鹽等的調節。對次級代謝產物合成途徑的調控，最終要歸結到發酵培養基以及培養條件的調控上。通過對這些因素的調控，以最大限度地調節代謝向合成產物方向進行，實現高產的目的。

煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY）是危害煙草、馬鈴薯、番茄、辣椒等茄科作物的常見病毒，尤其對煙草等主要經濟作物的生產造成極大危害且難以防治[12]，然而，目前低毒、高效、低殘留的天然抗病毒藥劑的選擇仍然較少[13]。

在前期研究的基礎上，本研究對粘質沙雷氏菌S3搖瓶發酵生產靈菌紅素的發酵條件和發酵液組分進行優化，確定最佳發酵液組分和發酵培養參數，為靈菌紅素的高產工業化提供試驗基礎；同時對靈菌紅素抗病毒活性進行初步驗證，結合農業產業化需求，以最大經濟性實現粘質沙雷氏菌S3的靈菌紅素產量和抗病毒活性的雙重提升。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株-S3（GenBank：MK411566.1）由中國農業科學院煙草研究所植保中心病毒實驗室獲得并保存。已完成對該菌株的形態學觀察、生理生化鑒定、16S rDNA鑒定[14]。

供試煙草：本氏煙（），由中國農業科學院煙草研究所植保中心病毒實驗室提供。

病毒毒源：TMV、CMV、PVY毒源植株均保存于中國農業科學院煙草研究所植保中心病毒實驗室。

平板培養基：LB固體培養基；種子培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.5%，氯化鈉0.5%，超純水97.5%；發酵培養基：按照1.2.5試驗結果對種子培養基進行改進。

主要試劑：牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、丙三醇、油酸及蔗糖購于國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨及吐溫80購于Sigma-Aldrich貿易有限公司；酵母粉購于北京奧博星公司；LB肉湯、瓊脂粉購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 取保存于?80 ℃的粘質沙雷氏菌菌株，在LB固體平板培養基上過夜活化后，挑取單菌落分別置于裝有50 mL種子培養基的100 mL三角瓶中，28 ℃，160 r/min條件下培養24 h，得到種子液。向發酵培養基加入體積總量10%的種子液，在28 ℃，pH 6.0，160 r/min條件下發酵60 h。

1.2.2 菌體生物量測定 取20 mL發酵液裝入已知質量的50 mL離心管中，10?000 r/min離心20 min，棄上清，用蒸餾水洗滌后再離心，重復2次，余下的濕菌體置于80 ℃烘箱中烘干至恒重，測菌體干質量。

1.2.3 靈菌紅素含量測定 采用比色法測定，取發酵液0.5 mL，加入酸性甲醇（pH 3.0）4.5 mL，混合均勻，靜置30 min萃取胞內色素，離心后取上清液檢測吸光度534[2]，用以表示靈菌紅素產量。

1.2.4 培養條件的優化 依次進行以下條件的優化，每次都將上一優化結果應用于下一因素的優化。光照強度：0、100、500、1000 cd；pH值：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；溫度：22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃；振搖速度：0、60、100、160、180、200 r/min。發酵60 h后，測定每組發酵液中菌體干質量和靈菌紅素產量。

1.2.5 培養基成分的優化 在初始發酵培養基和已優化因素的基礎上，對最佳碳源、氮源、無機鹽種類進行優選。碳源：0.5%的葡萄糖、蔗糖、丙三醇和牛肉膏；氮源：1%的無機氮源物質硫酸銨、氯化銨和有機氮源物質蛋白胨、酵母粉、尿素；無機鹽：0.2%的MgCl2、CaCl2、KCl、MgSO4。發酵60 h后，測定每組發酵液中菌體干質量和靈菌紅素產量。

1.2.6 靈菌紅素的獲取 將粘質沙雷氏菌發酵液和乙酸乙酯按照1∶1體積混合，期間多次攪拌，加速靈菌紅素的萃取；乙酸乙酯處理發酵液2～3 d后，取紅色上清（濾去不溶性雜質）至旋轉蒸發儀上進行蒸發，得到靈菌紅素粗提物[15]，再通過層析純化獲得靈菌紅素精提物。

1.2.7 抗病毒活性的測定 取新鮮毒源葉片研磨勻漿后，在本氏煙葉片上摩擦接種病毒，24 h后用濃度為10 μg/mL的靈菌紅素溶液噴釋植株，等量去離子水和10 μg/mL的氨基寡糖素溶液分別作為空白對照和陽性對照。72 h后提取系統葉總RNA，反轉錄[16]，進行qRT-PCR進行病毒量的檢測，以測定抗病毒活性。

1.3 數據分析

試驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，應用Kruskal-Wallis t檢驗進行差異顯著性分析，并使用GraphPad Prism 8制作圖表。

2 結 果

2.1 發酵條件對靈菌紅素的影響

2.1.1 光照強度對靈菌紅素產量的影響 由圖1可知，光照強度對粘質沙雷氏菌體的生長沒有顯著影響，但是對靈菌紅素的產量影響顯著。無光照時靈菌紅素的產量最多，534為0.443。隨著光照強度的增加，靈菌紅素的產量不斷下降，光照越強下降的比例越大。

2.1.2 pH對靈菌紅素產量的影響 由圖2可知，粘質沙雷氏菌體質量和靈菌紅素產量都隨著初始pH的變化而發生變化，當pH值為6.0時兩者的量均達到最大值，菌體干質量濃度為1.906 g/L，534達0.416。因此，pH 6.0是粘質沙雷氏菌高產靈菌紅素的最優pH。

2.1.3 培養溫度對靈菌紅素產量的影響 由圖3可知，培養溫度在22～32 ℃的范圍內，隨著溫度的上升粘質沙雷氏菌體質量和靈菌紅素產量均先增多后減少。菌體干質量濃度在培養溫度為30 ℃時最大為1.934 g/L；靈菌紅素產量在溫度為28 ℃時最高，534為0.413。

2.1.4 振搖速度對靈菌紅素產量的影響 由圖4可知，速度在0～200 r/min范圍內變化時，隨著振搖速度增大，粘質沙雷氏菌生長速度加快，菌體富集增多；然而其合成的次級代謝產物靈菌紅素產量先隨振搖速度的加快而增多，但是繼續增快時，發酵液中次級代謝產物的產量減少。由于本試驗的目的在于后期分離純化靈菌紅素，因此要選擇最適代謝靈菌紅素的發酵條件，故最佳振搖速度為160 r/min。

注：誤差線表示3組重復的標準差，**表示差異顯著（p＜0.05）。下同。

圖2 pH對靈菌紅素產量的影響

圖3 溫度對靈菌紅素產量的影響

圖4 振搖速度對靈菌紅素產量的影響

2.2 發酵液組分的優化

2.2.1 碳源對靈菌紅素產量的影響 由圖5可知，粘質沙雷氏菌發酵的過程中，以丙三醇為碳源物質時靈菌紅素的產量最高，534為0.943。當選擇牛肉膏作為碳源物質時，雖然粘質沙雷氏菌菌體質量增長顯著，但嚴重限制了靈菌紅素的合成。因此根據試驗的結果，將丙三醇定為粘質沙雷氏菌發酵合成靈菌紅素的最佳碳源物質。

2.2.2 氮源對靈菌紅素產量的影響 由圖6可知，添加無機氮源硫酸銨和氯化銨時，粘質沙雷氏菌的干質量和靈菌紅素的產量均較少；將無機氮源換成有機氮源時，靈菌紅素的產量有顯著增加，尤其是添加蛋白胨時靈菌紅素的產量最高，534達到了0.964。添加酵母粉后，雖然菌體質量達到了最大值，但菌體生長過于迅速，抑制了靈菌紅素合成。因此，蛋白胨是粘質沙雷氏菌發酵高產靈菌紅素最合適的氮源物質。

2.2.3 無機鹽對靈菌紅素產量的影響 由圖7可知，當以無機鹽作為單因素時，分別添加MgCl2、CaCl2、KCl、MgSO4四種不同無機鹽時，靈菌紅素的產量均不同程度增加，說明Mg2+、Ca2+、K+均能起到促進靈菌紅素合成的作用，并且其中促進作用最為顯著的是K+，同時粘質沙雷氏菌菌體的生長量也有所增加。根據上述結果，為了得到高產量的靈菌紅素，粘質沙雷氏菌S3發酵培養基需要添加無機鹽KCl起到促進作用。

2.3 靈菌紅素的抗病毒活性

如圖8所示，分別接種TMV、CMV和PVY后，靈菌紅素提取物處理組的病毒含量與空白對照組相比均非常低，TMV、CMV和PVY的病毒積累量分別是空白對照的12.61%、29.41%和17.69%，差異顯著，抑制效果優于氨基寡糖素。可見，靈菌紅素對TMV、CMV和PVY的侵染復制具有較強的抑制作用，說明噴施靈菌紅素溶液對煙草病毒病有較好的防治潛力。

圖5 碳源對靈菌紅素產量的影響

圖6 氮源對靈菌紅素產量的影響

圖7 無機鹽對靈菌紅素產量的影響

圖8 靈菌紅素的抗病毒效果

3 討 論

在動物病毒病防治應用研究中，靈菌紅素主要通過改變細胞內pH[17]、阻斷細胞自噬[18]、裂解DNA分子[19]等多種方式抑制多種病毒感染、增殖。本研究證明了靈菌紅素可以有效抑制煙草病毒病的侵染和復制。在國際市場上，靈菌紅素制劑價格高昂，生物合成效率較低，應用成本較高，這是其難以在醫學和農業領域進行推廣的主要因素。特異性產生靈菌紅素的粘質沙雷氏菌S3菌株的穩定生長代謝是高通量獲得靈菌紅素的保障。

光照能促進多種微生物和植物的生長、繁殖和運動等生命活動，但相關文獻表明靈菌紅素對光敏感，光照不利于其合成[20]。發酵過程中有光照射會使得靈菌紅素的產量大幅度減少，表明粘質沙雷氏菌的發酵應盡量避光。pH的變化影響著機體的代謝和生長繁殖，粘質沙雷氏菌的生長過程會改變發酵液pH，從而使靈菌紅素合成受阻[9]，因此在培養過程中要不斷調節發酵液的pH，以保持pH的恒定。溫度是影響微生物生命活動的重要因素，在粘質沙雷氏菌發酵過程中保持適合的培養溫度，有利于縮短其發酵周期和提高靈菌紅素產量。本研究中粘質沙雷氏菌發酵產靈菌紅素的適宜溫度為28 ℃，這與已報道的粘質沙雷氏菌產靈菌紅素的最佳發酵溫度28 ℃一致[21-22]。微生物發酵工藝過程中，搖瓶轉速直接影響發酵基質的傳遞和微生物對營養物質的利用，并且在一定水平上影響著發酵液中的溶氧程度[20]，最終決定發酵生產能力和產品質量。本試驗發現，搖瓶發酵時振搖速度在160 r/min時有利于菌體的代謝生長，為工業化高產靈菌紅素提供幫助。

微生物的生長繁殖和發酵產物的合成都需要碳源和氮源物質。價格更為低廉的碳源有利于在工業化生產靈菌紅素的過程中降低成本。適量添加的丙三醇在提高靈菌紅素的產量方面具有一定優勢，且不會漂浮在發酵液上方阻礙氣體交換[23]。微生物發酵使用的氮源分為有機氮源和無機氮源。無機氮源成分單一，質量較穩定，可被快速利用；有機氮源營養豐富，因而微生物在含有機氮源的培養基中常表現出生長旺盛、菌體濃度增長迅速等特點[24]。靈菌紅素的基本分子結構是三個吡咯環[2]，其合成原料來源于氨基酸。無機鹽具有很多生理作用，如組成組織和細胞的結構，有些為無機或有機化合物以構成酶的輔基、激素、維生素、蛋白質和核酸的成分，或作為多種酶系統的激活劑，參與許多重要的生理功能，并且無機鹽離子參與調節細胞膜的通透性，確保滲透壓水平正常以及pH值穩定[25]。通過試驗，我們確定產靈菌紅素的粘質沙雷氏菌最佳發酵液成分為丙三醇、蛋白胨、氯化鈉、氯化鉀。

研究結束后，在生產工廠按照本研究優化后的發酵培養條件在50 L-5 T發酵罐中進行了發酵，發現可有效提高靈菌紅素的產量，相較于報道的500～2000 mg/L的靈菌紅素產率[26]也維持在較高水平。由于粘質沙雷氏菌屬于兼性厭氧菌，因此發酵液溶氧值建議溶氧探頭實時監控，保持微量通氣即可。pH可用pH探頭實時監控，并通過發酵系統軟件恒定為pH 6.0。發酵溫度控制在28 ℃，罐內攪拌轉速保持在160 r/min。

隨著人們食品安全意識的提高和環保觀念的增強，現代農業更加關注農藥應用導致的健康損害以及環保問題[27]，重污染的化學農藥逐漸退出市場，需要低毒、高效、低殘留的天然農藥不斷推陳出新。作為一種新型的植物免疫誘抗劑，靈菌紅素生產成本的降低不但有利于其抗病毒活性的基礎研究，更有巨大的市場推廣潛力。

4 結 論

本研究確定粘質沙雷氏菌S3制備靈菌紅素的最佳發酵培養基為：丙三醇、蛋白胨、氯化鈉、氯化鉀、吐溫-80質量分數分別為0.5%、1.5%、0.5%、0.25%、0.3%；發酵工藝參數為：接種量10%，裝液量60%～70%，發酵周期60 h，培養溫度28 ℃，振搖速度160 r/min。優化后的發酵培養基和發酵條件可有效提高靈菌紅素的產量，對于規模化制備靈菌紅素具有重要指導意義。

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Process Optimization and Antiviral Activity of High Yielding Prodigiosin from

GE Ming1, FENG Jia1, LI Ying1, JIAO Yubing1, SHEN Lili1, WANG Fenglong1, LI Bin2, LI Wengang2, LIU Dongyang3, WANG Yong3, JIANG Lianqiang3, ZHANG Mingjin4, YAN Fangfang5, YANG Yu5*, YANG Jinguang1*

(1. Institute of Tobacco Research of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Sichuan Province Company of China Tobacco Corporation, Chengdu 610017, China; 3. Liangshan Prefecture Company of Sichuan Tobacco Corpoation, Xichang, Sichuan 615000, China; 4. Luzhou City Company of Sichuan Tobacco Corpoation, Luzhou, Sichuan 646000, China; 5. Panzhihua City Company of Sichuan Tobacco Corpoation, Panzhihua, Sichuan 617000, China)

In order to improve the yield of prodigiosin in the industrial fermentation of-S3, the important fermentation condition parameters and key components of the fermentation broth of-S3 were optimized, and the inhibitory effect of the extracts of fermentation broth on viral diseases was verified. The results showed that the best medium formulation was: 0.5% of glycerol, 1.5% of peptone, 0.5% of sodium chloride and 0.25% of potassium chloride. The optimal fermentation conditions were: 10% inoculum, 60%-70% loading, constant pH of 6.0, incubation temperature of 28 ℃, stirring speed of 160 r/min, and 60 h fermentation cycle, which not only facilitated the growth of-S3, but also maximized the production of prodigiosin. After fermentation under the optimized conditions, the extract solution of prodigiosin was sprayed oninoculated with TMV, CMV and PVY, and the amount of TMV, CMV and PVY viruses in leaves was 12.61%, 29.41% and 17.69% of that in the blank control, respectively. The inhibitory effect on viruses was better than that of chitosan oligosaccharide. The fermentation conditions obtained from this study can improve the yield of prodigiosin, and the extracts have significant antiviral property, which has the potential for industrial development and economic application value.

; prodigiosin; optimization of fermentation conditions; plant antiviral agent

S435.72

A

1007-5119（2022）03-0020-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.03.004

山東省自然科學基金（ZR202103070049）；中國煙草總公司重大科技項目[110201901041（LS-04），110101601024（LS-04）]；四川省煙草公司科技項目（SCYC202008）；河南省煙草公司洛陽市公司科技項目（2020410300270076）；云南省煙草公司科技項目（2020530000241011）

葛 明（1996-），男，在讀碩士，主要從事分子病理學研究。E-mail：18653008590

，E-mail：楊 宇，405425592@qq.com；楊金廣，yangjinguang@caas.cn

2021-10-05

2022-05-31