不同ω-3多不飽和脂肪酸對斑馬魚阿爾茨海默病模型記憶損傷和神經(jīng)病理學(xué)變化影響

鐘綺媚，張晶晶，楊志友，鄧淑怡，王佳佳，張 才，張永平，宋 采

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518120；3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；4.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524088）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是常見的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，臨床上以認(rèn)知障礙、記憶衰退等表現(xiàn)為特征。AD 發(fā)病因子包括細(xì)胞外沉積的β 淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）、磷酸化tau（ptau）形成的胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)和乙酰膽堿（acetyl‐choline，ACh）缺乏。目前針對這些因子的藥物療效極微。近年來，筆者團(tuán)隊(duì)和其他研究者提出并證明神經(jīng)炎癥在AD 發(fā)病中的重要角色。神經(jīng)炎癥以小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活為主要特征。神經(jīng)元老化和活性氧產(chǎn)生增加，外周免疫炎癥反應(yīng)均可能激活膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[1]。其中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活分為促炎M1 和抗炎M2 亞型。小膠質(zhì)細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的巨噬細(xì)胞（CAMs）功能十分相似，前者過度激活是誘導(dǎo)情感和神經(jīng)退行性疾病的原因之一。最新研究比較小膠質(zhì)細(xì)胞和CAMs的特征，確定己糖胺半乳糖苷酶亞基β（Hexb）是穩(wěn)定表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞核心基因[2]。在突變Hexb 和APP轉(zhuǎn)基因小鼠中，皮質(zhì)和海馬中的Aβ 斑塊減少[3]。此外，在AD 患者大腦中還發(fā)現(xiàn)Hexb 增加[4]，Hexb 被認(rèn)為與M1型激活相關(guān)，因此，本研究選擇Hexb作為小膠質(zhì)M1亞型激活標(biāo)記物。與此相似，星形膠質(zhì)細(xì)胞的極化亦可產(chǎn)生促進(jìn)炎癥級聯(lián)反應(yīng)和神經(jīng)保護(hù)的作用（如釋放BDNF）。由于膠質(zhì)纖維酸性蛋白（gli‐al fibrillary acidic protein，GFAP）作為整體星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，在AD 患者中表達(dá)增加[5]，本研究選擇GFAP 和BDNF 作為星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。外周炎癥激活腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞引起神經(jīng)炎癥，環(huán)境毒素如鋁造成外周炎癥過度反應(yīng)，促炎因子通過血腦屏障，激活腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞并釋放促炎癥因子，促進(jìn)Aβ 產(chǎn)生，神經(jīng)元纖維纏結(jié)和乙酰膽堿酯酶活性增強(qiáng)，加速神經(jīng)元變性死亡[6]。由于目前尚無藥物能阻止或逆轉(zhuǎn)AD 進(jìn)程，且大部分臨床藥物毒副作用顯著。因此，探索AD 神經(jīng)免疫學(xué)機(jī)制，尋找天然具有抗炎作用的活性物質(zhì)或藥物成為治療AD熱點(diǎn)。

ω-3 PUFAs包括二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic acid，DPA)和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），主要來源于海洋生物或深海魚類等。紅細(xì)胞ω-3 PUFAs含量的降低與神經(jīng)細(xì)胞衰老和大腦認(rèn)知功能減退成正比[7]。筆者團(tuán)隊(duì)曾首次和多次報(bào)道EPA 的抗炎機(jī)制，如抑制促炎細(xì)胞因子的合成，促使巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 表型極化[8]，刺激星型膠質(zhì)細(xì)胞A2 的激活，增加BDNF 的產(chǎn)生[9]，逆轉(zhuǎn)IL-1β 對記憶神經(jīng)遞質(zhì)ACh 釋放的抑制，進(jìn)而改善記憶[10]。近年來，筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)EPA 可能通過增加DPA 含量發(fā)揮抗炎和改善記憶的作用，其機(jī)制為DPA 激活神經(jīng)元BDNF/TrkB-PI3K/AKT 通路，保護(hù)神經(jīng)元免受炎癥誘導(dǎo)的損傷[11]。但DPA 在抑制中樞神經(jīng)炎癥和膠質(zhì)細(xì)胞功能，以致改善認(rèn)知的作用尚不明晰。而腦內(nèi)含量最高的PUFAs DHA 被報(bào)道具有更顯著的抗衰老和改善記憶的作用。例如，紅細(xì)胞DHA 含量的降低與神經(jīng)細(xì)胞衰老和大腦認(rèn)知功能減退成正比[7]。目前，尚未見三種ω-3 PUFAs在預(yù)防和改善AD 認(rèn)知和記憶障礙差異和各自優(yōu)勢，以及其對神經(jīng)炎癥治療機(jī)制的研究報(bào)道。

斑馬魚（Danio rerio）因腦區(qū)功能與哺乳動物具有較大的同源性，如端腦負(fù)責(zé)記憶功能與哺乳動物海馬區(qū)功能相似[12]，而被逐步用于研究神經(jīng)退行性疾病。鋁離子能夠誘導(dǎo)AD 相似的神經(jīng)免疫學(xué)變化，文獻(xiàn)[13]報(bào)道鋁能夠成功地誘導(dǎo)斑馬魚AD 模型。因此，本研究采用鋁誘導(dǎo)斑馬魚AD 模型并檢測其認(rèn)知和記憶行為、腦內(nèi)Aβ、p-tau、AChE、IL-1β濃度和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Hexb、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、BDNF的mRNA變化，比較研究EPA、DPA和DHA對AD模型的影響，以期為海洋天然產(chǎn)物ω-3 PUFAs保健產(chǎn)品應(yīng)用和開發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6-8 月齡野生型斑馬魚（上海佳譽(yù)水族館）；棕櫚油（廣州果漾生物科技有限公司，批號FC-0320）；EPA（純度85%，批號20180705）、DPA（純度60%，批 號TZSW210402-1）和DHA（純 度85%，批 號20171105）均購自西安通澤生物科技有限公司；六水合氯化鋁（西隴科學(xué)股份有限公司，批號7784-13-6）；斑馬魚AChE（批號202110）、p-tau（批號202101）、Aβ1-42（批號201911）和IL-1β（批號202110）試劑盒均購自深圳子科生物科技有限公司；Trizol RNA 抽提試劑（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號R223-01）和SYBR Green 熒光染料（批號Q311-02）均購自南京諾維贊生物科技有限公司；引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鋁激活轉(zhuǎn)基因幼魚腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞 應(yīng)用小膠質(zhì)細(xì)胞被熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（coro1α:eGFP）（由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床研究中心斑馬魚平臺提供）產(chǎn)卵，將受精后3 d（days post-fertilization，dpf）的具有熒光標(biāo)記的幼魚隨機(jī)分組，在盛有胚胎水的24 孔板(孔徑15.6 mm)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每天定時記錄存活率。通過前期毒性篩選，確定分組為對照組，使用pH 計(jì)（上海力辰儀器科技有限公司）調(diào)節(jié)溶液酸堿度至6.0±0.2，含鋁質(zhì)量濃度40、45 mg/L為模型組，使用質(zhì)量濃度0.002%三卡因麻醉和羧甲基纖維素固定后，在共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）20 倍鏡下采集經(jīng)鋁誘導(dǎo)4 d 后的幼魚相同位置的小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況，激發(fā)波長為488 nm，曝光時間1 s，所有圖像均在相同條件下進(jìn)行采集[14]。使用Image J 軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 野生型斑馬魚隨機(jī)分成5組：對照組、模型組及EPA、DPA和DHA治療組。參照文獻(xiàn)[13]的AD模型建立方法，其中模型組及治療組斑馬魚暴露在pH 為6.0 ± 0.2 含鋁離子質(zhì)量濃度為100 μg/L 水中，同時模型組喂食含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的棕櫚油飼料，EPA、DPA 和DHA 治療組對應(yīng)地喂食含飼料質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的EPA、DPA和DHA飼料[15]；對照組僅在pH 為6.0±0.2的水中養(yǎng)殖；每天測量并使用鹽酸調(diào)節(jié)酸堿度。實(shí)驗(yàn)周期為30 d。

1.2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分為新物體識別實(shí)驗(yàn)和獎賞記憶實(shí)驗(yàn)，行為結(jié)果由欣軟軟件（上海欣軟信息科技有限公司）分析。

新物體識別實(shí)驗(yàn)檢測成年斑馬魚認(rèn)知水平，參照Cognato 等[16]的測試方法。T 迷宮由透明有機(jī)玻璃制成，外部各臂粘有黑色塑料自黏膜，黑色塑料自黏膜上被裁出正方形、三角形和圓形的視覺提示卡片。實(shí)驗(yàn)時長共2 d，訓(xùn)練期：測試前一天將每組斑馬魚從開始臂放入，關(guān)閉新臂，讓其在開始臂、訓(xùn)練臂自由活動30 min；測試期：打開新臂，逐一把斑馬魚從開始臂放入，使其自由探索迷宮5 min，記錄到達(dá)新臂的潛伏期（第一次進(jìn)入新臂的時間）和在新臂活動的時長。

獎賞記憶實(shí)驗(yàn)參考Darland等[17]的方法，略有修改，應(yīng)用食物獎勵使斑馬魚對投食臂具有偏好性，以評價(jià)其記憶能力。訓(xùn)練期：將投食環(huán)放置在左右末端處，把每組斑馬魚從開始臂放入，每10 min 向獎勵臂端投食環(huán)中放入少量飼料，自由活動30 min。測試期：訓(xùn)練結(jié)束后24 h，撤去投食環(huán)，把魚從長臂放入，使其探索迷宮5 min，記錄到達(dá)喂食臂的潛伏期（第一次進(jìn)入獎勵臂的時間）和在喂食臂活動的時長。測試完畢后，當(dāng)天按訓(xùn)練模式放置投食環(huán)進(jìn)行強(qiáng)化記憶訓(xùn)練，每組20 min，每10 min 在投食環(huán)中放入少量魚食。第3、4、5 天重復(fù)第2 天的實(shí)驗(yàn)步驟，第5天測試完畢后不再強(qiáng)化記憶訓(xùn)練。

1.2.4 Aβ、p-tau、AChE、IL-1β 濃度檢測 根據(jù)Elisa試劑盒說明書檢測斑馬魚腦組織AChE、p-tau、Aβ1-42和IL-1β蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5 熒光定量PCR 檢測 提取斑馬魚腦組織mRNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄得cDNA，進(jìn)行RT-PCR 檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Hexb、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP 和BDNF 的mRNA 變化（引物序列見表1），將目的基因相對于管家基因Actin的表達(dá)進(jìn)行△△CT校正[18]。

表1 熒光定量PCR引物序列Table1 Primer sequence of qPCR

2 數(shù)據(jù)處理

本研究數(shù)據(jù)均采用Graph Pad Prism 8.0.2 統(tǒng)計(jì)軟件處理，方差齊性數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進(jìn)行LSD 檢驗(yàn)，其中小膠質(zhì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度和獎賞記憶行為結(jié)果使用t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 鋁質(zhì)量濃度對斑馬魚幼魚腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

由圖1可見，與對照組相比，鋁處理后轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（coro1α:eGFP）幼魚腦中，熒光標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增多，在一定濃度范圍內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨鋁質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)，證明斑馬魚幼魚小膠質(zhì)細(xì)胞被鋁激活。

圖1 鋁對Tg（coro1α:eGFP）斑馬魚小膠質(zhì)細(xì)胞的影響Fig.1 Effect of aluminum on Tg(coro1α:eGFP)zebrafish microglia

3.2 EPA、DPA和DHA對鋁致斑馬魚認(rèn)知障礙的影響

由圖2可見，與對照組相比，鋁顯著延長斑馬魚到達(dá)新臂的潛伏期（P<0.05）并顯著降低在新臂的活動時間（P<0.01）；與模型組相比，EPA、DPA 和DHA 顯著增加斑馬魚在新臂的活動時間（P<0.01），但對到達(dá)新臂的潛伏期無顯著影響。這表明EPA、DPA 和DHA 均可部分改善鋁致斑馬魚的新物體識別障礙。

圖2 EPA、DPA和DHA對鋁致斑馬魚認(rèn)知障礙的影響Fig.2 Effects of EPA,DPA and DHA on aluminum-induced cognitive impairment in zebrafish

3.3 EPA、DPA和DHA對鋁致斑馬魚記憶障礙的影響

由圖3可見，與對照組相比，鋁顯著增加斑馬魚到達(dá)獎勵臂的潛伏期（D1：P<0.05，D4：P<0.001）；與模型組相比，EPA、DPA 和DHA 均顯著降低模型組到達(dá)獎勵臂的潛伏期（D1：P<0.05）。與對照組相比，模型組顯著減少獎勵臂的活動時間（D1：P<0.05，后三天均為P<0.001）；與模型組相比，EPA（前三天均為P<0.05，D4：P<0.01）、DPA（D1：P<0.05，D3：P<0.01，D4：P<0.05）和DHA（D4：P<0.01）治療組均顯著增加在獎勵臂的活動時間。這表明，EPA、DPA 和DHA 均可部分改善鋁導(dǎo)致斑馬魚的記憶障礙。其中，EPA 的改善效果最佳，DHA次之，DPA較差。

圖3 EPA、DPA和DHA對鋁致斑馬魚記憶障礙的影響Fig.3 Effects of EPA,DPA and DHA on memory impairment caused by aluminum in zebrafish

3.4 EPA、DPA 和DHA 對鋁致斑馬魚Aβ1-42蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖4可見，與對照組相比，模型組斑馬魚腦內(nèi)Aβ蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著增加（P<0.001）；與模型組相比，EPA、DPA 和DHA 均顯著降低Aβ 蛋白的濃度（P<0.001）。這表明三種ω-3 PUFAs 均有抑制Aβ沉積的效果。

圖4 EPA、DPA和DHA對鋁致Aβ1-42蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effects of EPA,DPA and DHA on the amount fraction of Aβ1-42 protein caused by aluminum

3.5 EPA、DPA 和DHA 對鋁致斑馬魚p-tau 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖5可見，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織p-tau蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（P<0.01）；EPA（P<0.001）和DPA（P<0.01）均顯著降低p-tau 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，DHA 無顯著影響。這表明EPA 降低p-tau 的作用最佳，DPA次之，DHA較差。

圖5 EPA、DPA和DHA對鋁致p-tau蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effects of EPA,DPA and DHA on the amount fraction of p-tau protein caused by aluminum

3.6 EPA、DPA 和DHA 對鋁致斑馬魚AChE 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖6可見，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織的AChE 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（P<0.01）；與模型組相比，EPA（P<0.05）、DHA（P<0.01）顯著降低AChE 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，DPA 治療組與模型組比較無顯著影響。這表明DHA 降低AChE 的作用最佳，EPA次之，DPA的效果較差。

圖6 EPA、DPA和DHA對鋁致AChE蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 Effects of EPA,DPA and DHA on the amount fraction of AChE protein caused by aluminum

3.7 EPA、DPA 和DHA 對鋁致斑馬魚IL-1β 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖7可見，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織IL-1β 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（P<0.01）；與模型組相比，EPA 顯著降低IL-1β（P<0.05）；DPA 和DHA與模型組比較，無顯著影響。這表明EPA抗中樞炎癥的作用最佳。

圖7 EPA、DPA和DHA對鋁致IL-1β蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.7 Effects of EPA,DPA and DHA on the fraction of IL-1β protein caused by aluminum

3.8 EPA、DPA 和DHA 對鋁致Hexb mRNA 表達(dá)的影響

由圖8可見，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織總的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Hexb 的mRNA 表達(dá)顯著增加（P<0.05）；在EPA治療組，Hexb的mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01），DPA 和DHA 組無顯著影響。表明EPA抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用最佳。

圖8 EPA、DPA和DHA對鋁致Hexb mRNA表達(dá)的影響Fig.8 Effects of EPA,DPA and DHA on Hexb mRNA expression caused by aluminum

3.9 EPA、DPA 和DHA 對鋁致GFAP mRNA 表達(dá)的影響

由圖9 可見，與對照組相比，鋁誘導(dǎo)后，斑馬魚腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.01）；EPA、DPA 和DHA 均顯著降低其表達(dá)（P<0.01），表明EPA、DPA 和DHA 均有抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用。

圖9 EPA、DPA和DHA對鋁致GFAP mRNA表達(dá)的影響Fig.9 Effects of EPA,DPA and DHA on GFAP mRNA expression caused by aluminum

3.10 EPA、DPA 和DHA 對鋁致BDNF mRNA 表達(dá)的影響

由圖10 可見，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織BDNF 僅有輕度下降；EPA（P<0.05）干預(yù)顯著增加BDNF 的mRNA 表達(dá)。DPA 和DHA 組與模型組比較無顯著影響。

圖10 EPA、DPA和DHA對鋁致BDNF mRNA表達(dá)的影響Fig.10 Effects of EPA,DPA and DHA on aluminuminduced BDNF mRNA expression

4 討論

本研究證明在熒光標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（coro1α:eGFP）幼魚腦中鋁激活小膠質(zhì)細(xì)胞并隨鋁質(zhì)量濃度升高而加劇。與之對應(yīng)，成年斑馬魚腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Hexb 的mRNA 水平上升，增加釋放促炎因子IL-1β，這與鋁引起大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活的結(jié)果一致[19]。但由于喂食斑馬魚幼魚ω-3 PUFAs 較為困難，則在成年野生型斑馬魚比較研究ω-3 PUFAs 對鋁致斑馬魚認(rèn)知、記憶損傷和病理變化的改善作用。

本研究結(jié)果顯示鋁誘導(dǎo)的斑馬魚模型出現(xiàn)認(rèn)知和記憶障礙，且腦內(nèi)Aβ、p-tau、AChE 和IL-1β 顯著增高，以神經(jīng)炎癥為標(biāo)志的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被顯著激活，這些變化均符合AD 患者的病理變化，表明此AD斑馬魚模型成立。

臨床實(shí)驗(yàn)表明，長期攝入ω-3 PUFAs 能夠改善衰老和早期AD 引起的認(rèn)知和記憶衰退[20]，本研究的行為結(jié)果進(jìn)一步支持該臨床研究發(fā)現(xiàn)。在新物體識別實(shí)驗(yàn)中，EPA、DPA 和DHA 均可部分改善鋁致斑馬魚的新物體識別障礙，三者效果相似。在獎賞記憶實(shí)驗(yàn)中，EPA、DPA 和DHA 均可部分改善鋁致斑馬魚的記憶障礙，EPA 改善效果最佳，DHA 次之，DPA 較差。針對AD 的有關(guān)病理標(biāo)志物，本研究發(fā)現(xiàn)EPA、DPA和DHA改善作用機(jī)制各不相同。

從ω-3 PUFAs 合成代謝途徑來看，EPA 在體內(nèi)通過產(chǎn)生中間代謝物DPA 形成DHA，DPA 在肝臟和大腦中可部分轉(zhuǎn)化為EPA[21]。然而，大腦中DHA 的內(nèi)源性合成高于EPA 和DPA，三者的含量和代謝合成途徑均不相同。筆者團(tuán)隊(duì)和其他學(xué)者在臨床和其它動物模型曾報(bào)道EPA 和DHA 在改善抑郁癥和記憶障礙方面的差異[22-27]。在大鼠的慢性應(yīng)激抑郁模型中，EPA 比DHA 更好地抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活和相關(guān)的神經(jīng)炎癥以及NF-kB 信號，EPA 在改善星形膠質(zhì)細(xì)胞活性降低，促進(jìn)GDNF、NGF、BDNF 神經(jīng)營養(yǎng)素表達(dá)方面優(yōu)于DHA[28]。本研究在斑馬魚的AD 模型中再次證實(shí)EPA 在抗炎和恢復(fù)BDNF 表達(dá)方面比DHA 更有優(yōu)勢。由于EPA 在體內(nèi)含量極低及代謝迅速，但功能顯著，被認(rèn) 為EPA相當(dāng)于第二信使[29]。而DPA 是EPA 向DHA 轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物。筆者團(tuán)隊(duì)最新發(fā)現(xiàn)在抑郁的細(xì)胞模型DPA 可平衡小膠質(zhì)細(xì)胞M1 和M2 極化，并激活神經(jīng)元-BDNF/TrkB-PI3K/AKT 通路，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用[11]。在其他疾病干預(yù)中，DPA功能亦為獨(dú)特。例如，在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的小鼠模型中，DPA 表現(xiàn)出比EPA和DHA 更強(qiáng)的抗炎能力，其作者認(rèn)為可能源于DPA抑 制PGE2 和LTB4基質(zhì)的合成[30]。DPA在功能上也與DHA 具有更大的相似性，在心肌梗死發(fā)病后和出現(xiàn)癥狀之前，血漿中DPA 和DHA 衍生保護(hù)蛋白增加[31]。但在腦內(nèi)，本研究首次研究DPA 對AD樣病理變化的作用，其結(jié)果與其他學(xué)者在外周疾病的研究結(jié)果不盡相同，有待進(jìn)一步的探究。本研究使用的DPA 純度為60%，EPA 和DHA 的純度均為85%，在計(jì)算ω-3 PUFAs 占飼料質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%時，均除以其對應(yīng)純度，因此，喂食的ω-3 PUFAs 三者總量一致。此外，在廠家提供的檢測報(bào)告中，酸價(jià)（≤2.0 mg/g)、過氧化物(≤1.5 mmol)和膽固醇（≤2.0 mg/g）等含量極低，且在已有研究報(bào)道中，未發(fā)現(xiàn)以上濃度會影響DPA 功效和對中樞學(xué)習(xí)記憶具有改善作用[32]。

針對AD 最重要的標(biāo)記物Aβ，本研究發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFAs 顯著降低斑馬魚腦內(nèi)Aβ 蛋白，這和被喂食含ω-6/ω-3 比值較高的飼料的APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中Aβ增加的發(fā)現(xiàn)一致[33]；支持Grimm等[34]發(fā)現(xiàn)的EPA 和DHA 促進(jìn)Aβ 降解的結(jié)果，其機(jī)制可能與增加神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中胰島素降解酶相關(guān)。而本研究結(jié)果提示Aβ 降低也可能與EPA 的抗炎作用有關(guān)，因?yàn)楣P者團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道EPA 能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的Aβ 前體APP 的表達(dá)[35]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明EPA 降低IL-1β，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活進(jìn)而降低Aβ 蛋白濃度。據(jù)報(bào)道，膳食補(bǔ)充DHA 可通過不同機(jī)制減少Aβ的生成，包括調(diào)節(jié)APP 的定位，增加α-裂解和抑制β-裂解等[36]。然而DPA 抑制腦內(nèi)Aβ濃度的作用機(jī)制未見報(bào)道，需進(jìn)一步探究。

另一重要AD 病理標(biāo)記物，過度磷酸化tau 亦被ω-3 PUFAs 所改善。本研究發(fā)現(xiàn)，EPA 和DPA 可以顯著逆轉(zhuǎn)鋁升高的腦內(nèi)p-tau 濃度，Wen 等[37]也曾發(fā)現(xiàn)EPA 能夠抑制tau 過度磷酸化；而DHA 在哺乳動物中可以抑制p-tau 濃度[38]，本研究首次在斑馬魚AD 模型中研究DHA 對p-tau 濃度的作用，未發(fā)現(xiàn)DHA 顯著的變化，可能與實(shí)驗(yàn)動物種屬有關(guān)或需設(shè)計(jì)不同的實(shí)驗(yàn)。

針對AD 腦內(nèi)ACh 缺失，本研究發(fā)現(xiàn)EPA 和DHA均可以降低此代謝酶的濃度。這與De Oliveira等[39]報(bào)道攝入EPA 和DHA 可恢復(fù)腦內(nèi)AChE 濃度一致。筆者團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道外周和中樞炎癥能夠增加Aβ、p-tau 的表達(dá)，降低ACh 的釋放，本研究證明鋁離子引起促炎因子IL-1β 升高。EPA 降低IL-1β 蛋白濃度并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用，但其他兩種ω-3 PUFAs 沒有顯著的作用。這與筆者團(tuán)隊(duì)前期在抑郁癥和AD 模型上的多項(xiàng)發(fā)現(xiàn)相似，即EPA 在抗炎、抑制膠質(zhì)細(xì)胞炎癥亞型方面具有顯著的功能。在星形膠質(zhì)細(xì)胞方面，A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎，加速AD 進(jìn)程，而A2 型則產(chǎn)生BDNF，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。BDNF 顯著改善AD 大鼠（Rattus norvegicus）的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，增加海馬（Hippocampus）中乙酰膽堿的釋放和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，降低Aβ 蛋白濃度，抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[40]。GFAP 增加是星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志之一，可觸發(fā)神經(jīng)炎癥，而抑制炎癥可使GFAP 表達(dá)降低，促進(jìn)A2 型星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌BDNF[41]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)三種ω-3 PUFAs均能抑制鋁激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞，在斑馬魚的AD 模型上進(jìn)一步確認(rèn)其他學(xué)者的發(fā)現(xiàn)，即缺乏ω-3 PUFAs 的飲食造成星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和激活[42]。有研究顯示，在3×Tg AD 小鼠中，GFAP 的蛋白表達(dá)顯著下降[43]，這可能與斑馬魚強(qiáng)大的神經(jīng)再生功能發(fā)揮保護(hù)作用有關(guān)[44]。本研究證明EPA 促進(jìn)BDNF 表達(dá)，這可能來自EPA 獨(dú)特的強(qiáng)大抗炎作用。一方面，EPA是Δ5去飽和酶的抑制劑，抑制AA（炎癥物質(zhì)的前體）合成，并作為產(chǎn)生替代性花生四烯酸的底物；另一方面，EPA 還通過一組促分解介質(zhì)，即E系列溶解素發(fā)揮抗炎作用[29]。

本研究首次在轉(zhuǎn)基因斑馬魚上直觀地驗(yàn)證鋁對小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用，并在AD 模型上比較和研究EPA、DPA和DHA對記憶損傷和神經(jīng)病理學(xué)的改善作用，但其具體細(xì)胞和分子機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

5 結(jié)論

EPA 在改善鋁致斑馬魚認(rèn)知和記憶損傷、降低腦內(nèi)Aβ、p-tau和AChE蛋白濃度及炎癥反應(yīng)中有最佳作用；DPA 可改善鋁致斑馬魚認(rèn)知和記憶損傷、抑制Aβ、p-tau 和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的效果顯著；DHA 可改善鋁致斑馬魚認(rèn)知和記憶障礙，在降低Aβ、AChE 和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活方面有較大優(yōu)勢。這些發(fā)現(xiàn)首次為ω-3 PUFAs 在AD 中的應(yīng)用提供依據(jù)。