維生素D受體基因多態性與原發性癲癇的相關性

朱文葉 陳新元 李敏

摘要：目的：研究維生素D受體多態性與原發性癲癇的相關性。方法：通過病例對照研究，納入71例原發性癲癇患者作為病例組，同期97例健康者作為對照組，抽取所有研究對象外周靜脈血提取DNA，采用PCR-LDR法檢測維生素D受體單核苷酸位點Cdx-2、 FokI、BsmI及ApaI的多態性。結果：病例組和對照組Cdx-2、FokI、BsmI、ApaI的基因型、等位基因、顯性模型及隱性模型均沒有統計學意義（P>0.05）。結論：維生素D受體單核苷酸位點Cdx-2、FokI、BsmI及ApaI可能與原發性癲癇的發生不相關。

關鍵詞：維生素D受體;基因多態性;原發性癲癇

ABSTRACT： OBJECTIVE To investigate the association between vitamin D receptor gene polymorphism and primary epilepsy. METHEDS A case-control study was conducted in 71 patients with primary epilepsy and 97 healthy controls. DNA was extracted from peripheral venous blood of all subjects. Polymorphisms of vitamin D receptor gene Cdx-2、FokI、BsmI and ApaIwere detected by PCR-LDR direct sequencing. RESULTS There was no significant difference in all genotype frequency 、allele frequency 、dominant model and recessive model between case group and control group （P >0.05）. CONCLUSION The polymorphisms of vitamin D receptor gene Cdx-2 （rs11568820）、 FokI （rs2228570）、BsmI （rs1544410） and ApaI （rs7975232） may not be associated with primary epilepsy.

KEY WORDS： vitmin D receptor; gene polymorphism; primary epilepsy

癲癇是最常見及最具潛在危險性的、多種病因參與的一種慢性中樞系統疾病。目前關于癲癇確切的發病機制仍不清楚，一般認為是由多種大腦病理性改變的共同終點，如機械性創傷、出生缺氧、產傷、感染、中風、腫瘤。流行病學調查研究表明，遺傳因素作為內因在癲癇的發病機制中扮演重要的作用[1-2]。進來年發現越來越多的基因通過多種機制參與機體功能和發育過程，對癲癇的發生發展產生影響。不同個體應用抗癲癇藥物治療的反應性有很大的差異，這些差異性可能源于影響藥物代謝動力學的基因、影響藥物藥效學的基因和導致癲癇發作的基因突變[3-7]。

維生素D（vitamin D， VD）屬于脂溶性維生素，是一種維持人體生命所必須的營養物質，除調節鈣磷代謝、促進骨骼發育、調節生物細胞分化和免疫功能外，VD在神經系統調節方面也發揮著獨特作用。VD缺乏會引發神經系統疾病，包括多發性硬化、阿爾茨海默病、帕金森病以及癲癇等[8-11]。維生素D受體（vitamin D receptor， VDR）是核受體超家族成員之一，主要位于神經元和膠質細胞的細胞核中[12-13]。VDR與VD結合后通過信號通路的傳導，在中樞神經系統發揮著重要作用。研究表明糾正VD缺乏狀態可以控制癲癇發作，此外，動物實驗研究表明 [11]增加小鼠海馬區VD3 水平可以提高誘發癲癇的閾值;相反，敲除VDR會增加癲癇的發生風險。基于以上研究，我們推測VDR基因的多態性可能參與了癲癇的發生。因此，本研究將進行VDR SNPs Cdx-2 （rs11568820， G>A）， FokI （rs2228570， T>C）， BsmI （rs1544410， G>A）， ApaI （rs7975232， C>A）的多態性分析，探討VDR基因多態性是否與原發性癲癇發生相關。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2020年3月至7月來自昆明醫科大學第一附屬醫院神經內科的原發性癲癇患者共71例，其中男性26例（36.6%），女性45例（63.3%），年齡中位數為29（23，44），診斷標準符合《2017年國際抗癲癇聯盟制訂的癲癇發作及癲癇分類診斷指南》[14]。同期收集昆明醫科大學第一附屬醫院體檢中心健康受試者97例作為對照組，其中男性35例（36.0%），女性62例（63.9%），年齡中位數為37（30，47）。經醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA提取以及純度和濃度測定 采集研究對象外周靜脈血2 ml，按照TIANamp Blood DNA Kit， DP348的說明書提取全血DNA，使用核酸蛋白分析儀對提取出的DNA 樣本進行純度和濃度鑒定， OD260值和OD280值在1.6～1.8之間為合格。

1.2.2 PCR反應和SNP檢測 引物由安徽通用生物系統有限公司采用Primer3.0設計。PCR擴增：15 μL 體系：DNA 1 μL，10*bμffer1.5 μL，25 mmol/L 的 MgCl21.5 μL，10 mmol/L 的 DNTP 0.3 μL，10 μmol/L 上下游引物 0.15 μL，5 μmol/μL 的Tap 酶 0.3 μL，加 H2O 補足至15 μL。PCR擴增條件：94℃預變性3 min;94℃變性30s，55℃退火30 s;72℃延伸90 s;共35個循環，然后72℃延伸3min。 連接反應：10 μL體系：取 3μL PCR產物，10* Taq DNA ligase buffer 0.15 μL，Taq DNA ligase（40U/ul）0.125 μL，探針（10p） 0.01 μL，加 H2O 補足至10 μL。連接條件：94°C 30s，56°C 3min;共30個循環。然后取取1μL延伸產物，加8ul上樣，95℃變性3min，立即冰水浴，上測序儀。

1.2.3 統計學分析 運用IBM SPSS （version 25.0; Armonk， NY， USA）進行統計分析。分類變量采用卡方檢驗。基因型分布采用Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗。采用Logisitc回歸模型校正年齡、性別等變量，所有統計分析采用雙側檢驗，P <0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較 經χ2在檢驗，病例組與對照組的性別構成無統計學意義（P = 0.943），兩組性別構成均衡。

2.2 遺傳平衡檢驗 病例組和對照組VDR 4個SNPs 的基因型其觀察值與期望值之間分布近似（P >0.05），表明兩組樣本來自遺傳平衡群體，具有群體代表性。

2.3 VDR基因多態性與原發性癲癇的易感性分析

所有樣本進行VDR基因測序，BsmI未檢測到AA基因型，經χ2檢驗病例組和對照組VDR 四個SNPs基因型頻率無統計學意義（P >0.05）（見表1）;進一步采用多因素二元Logistic回歸，對受試者的年齡、性別進行校正，分析各位點等位基因模型、顯性模型和隱性模型與成人原發性癲癇的關系。結果顯示： Cdx-2 、FokI、BsmI及ApaI在病例組和對照組中其不同模型的分布均無統計學意義（見表2）。

3 討論

VD在神經系統中有調控腦發育、神經營養和保護、神經遞質合成和神經免疫調節等重要作用，是人體必需的神經類固醇，參與大腦復雜的功能活動[7]。VD缺乏與癲癇具有相關性。人體內VD水平降低會增加癲癇發生發展的風險;而癲癇人群中，內在或外在因素會導致體內VD水平下降[15]。本研究選取了其中4個SNPs進行研究。

FokI位于VDR基因的5’末端，其多態性與神經保護相關，發生突變會增加帕金森病、阿爾茲海默病、多發性硬化等神經系統疾病的風險[17-18]。Jiang[19]等發現 FokI AC基因型、ApaI AA基因型在顳葉癲癇組和對照組中的分布有統計學意義。Cdx-2位于VDR基因的5’啟動子區域，其多態性與2型糖尿病及胰島素分泌受損相關[20]。戴[21]等發現Cdx-2的基因型在癲癇組和對照組的分布具有統計學意義，而等位基因的分布沒有統計學意義，AG/（AA+GG）有統計學意義，Cdx-2的多態性可能與癲癇的發生相關。BsmI位于VDR基因的3’端第8內含子，其多態性研究主要集中在骨質疏松、糖尿病及神經系統疾病。研究表明VDR基因3’端BsmI、ApaI 均與神經系統疾病相關[22-23] 。

在本研究中所選取的VDR 4個SNPs在原發性癲癇和對照組中無論是基因型，還是各種基因模型中其分布均沒有統計學意義，其中BsmI （rs1544410）突變純合子 AA基因型在所有研究對象中均未檢出，這與戴[21]等的研究結果一致，同樣Jiang[19]等的研究中AA基因型的頻率也極低，很可能是樣本量太小導致的。VDR基因多態性可受種族、地域等因素影響，本研究所有樣本來自云南地區的人群，因樣本量較少且遺傳背景不同，病例組和對照組統計可能存在偏倚，后續將擴大樣本量，控制混雜因素如日照、VD攝入、種族、地域等，對原發性癲癇發病機制做進一步研究，若可以進行不同地區多中心研究。

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[基金項目] 云南省教育廳科學研究基金教師類項目（編號：2018JS197）

[作者簡介]朱文葉，主管藥師，研究方向：臨床藥理學，郵箱：ZWYkyfyy@163.com

[通訊作者]李敏，男，醫師，研究方向：哮喘與基因組學，郵箱：869116714@qq.com