基于PI3K/Akt 通路豨薟草抗腦缺血再灌注損傷作用機制研究

王文杰 徐煜彬 徐珊珊▲

1.浙江省臺州市中心醫院（臺州學院附屬醫院）神經內科，浙江臺州 318000；2.浙江省臺州市中心醫院（臺州學院附屬醫院）藥劑科，浙江臺州 318000

腦卒中具有發病率高、病死率高、致殘率高及復發率高的特點，恢復缺血區域的腦灌注是腦卒中治療的核心問題，而這也可能誘發進一步的組織損傷和功能障礙，即腦缺血再灌注（IR）損傷。IR 損傷在腦卒中的發病機制中起著至關重要的作用，因此，減少IR損傷是治療腦卒中的關鍵。

豨薟草出自《唐本草》，宜用于風濕痹癥、痿證及中風等。現代藥理學研究證實豨薟草具有改善微循環、抗血栓等作用，臨床主要用于腦缺血、冠心病等治療。本文基于PI3K/Akt 通路研究豨薟草抗IR 的作用機制，為豨薟草后續開發及臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠40 只，雌雄各20 只，平均體重（200±20）g，購自維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 藥物及試劑

豨薟草購自臺州愛康大藥房；IL-1β、IL-6、NFκB 和TNF-α 試劑盒購自南京建成生物有限公司；兔抗大鼠PI3K、Akt 購自美國CST 公司，RT-qPCR 試劑盒購自南京Vazyme。

1.3 動物分組及給藥

首先隨機將40 只大鼠分為假手術組、模型組和豨薟草水煎液低、中、高劑量組（分別相當于生藥0.45、0.90、1.35 g/kg），每組各8 只。給藥組分別灌胃給予豨薟草0.45、0.90、1.35 g/kg，或相同劑量的生理鹽水（模型組和假手術組），連續灌胃給藥14 d 之后采用改良線栓法進行造模，詳見參考文獻。

1.4 神經功能缺損評分

參照Longa 等神經功能缺損標準對IR 24 h 后的大鼠進行評分。

1.5 病理檢測

IR 24 h 后，各組大鼠隨機抽取2 只處死于冰面上取出大腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液并制備石蠟切片，采用蘇木素-伊紅染色，檢測其病理變化。

1.6 RT-PCR 和Western-blot 檢測

IR 24 h 后，隨機在各組抽取3 只大鼠，取出腦組織的缺血部分50 mg，采用Trizol 提取RNA，按照試劑盒說明進行逆轉錄，用于qPCR 反應。PCR 引物序列見表2。IR 24 h 后，取出腦組織的缺血部分50 mg，加入1 ml 的裂解液提取蛋白進行電泳，轉膜，封閉1 h，孵育一抗，4℃過夜，洗膜后孵育二抗2 h 后顯影成像，詳見文獻。

表2 PCR 引物序列

1.7 ELISA 檢測

再灌注24 h 后，參照操作說明采用ELISA 法檢測各組大鼠缺血腦組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 神經功能缺損評分

IR 24 h 后，神經功能缺損評分如下：假手術組為（0.00±0.00）分，模型組為（2.75±0.46）分，顯著高于假手術組（P＜0.01）；0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草組分別為（2.12±0.64）分及（1.50±0.53）分，與模型組相比顯著降低（P＜0.05 和P＜0.01），而0.45 g/kg 豨薟草組為（2.50±0.53）分，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 豨薟草水煎液對IR 模型大鼠腦組織病理變化的影響

HE 染色結果發現假手術組大鼠腦組織并無異常，模型組和0.45 g/kg 豨薟草組均可見大量炎性細胞浸潤；而0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草組大鼠腦組織可見少量炎性細胞浸潤。見封三圖3。

2.3 豨薟草對IR 模型大鼠腦組織PI3K 和Akt mRNA 表達的影響

與假手術組相比，模型組PI3K 與Akt mRNA 表達顯著上升（均P＜0.01）；而0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草組較模型組顯著降低（均P＜0.01）。見表3。

表3 豨薟草水煎液對IR 模型大鼠腦組織PI3K 和Akt mRNA 表達的影響（）

2.4 豨薟草對IR 模型大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量的影響

結果顯示IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量在模型組大鼠中較假手術組顯著升高（均P＜0.01）；給予0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草水煎液含量顯著降低（均P＜0.01）。見表4。

表4 豨薟草對IR 大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量的影響（ng/L，）

2.5 豨薟草對IR 模型大鼠腦組織PI3K 和Akt 蛋白表達的影響

結果顯示，模型組PI3K 和Akt 蛋白表達較假手術組顯著升高（均P＜0.01）；給予0.90 g/kg 和1.35 g/kg豨薟草后表達顯著降低（均P＜0.01）。見表5。

表5 豨薟草對IR 大鼠腦組織PI3K 和Akt 蛋白表達的影響（）

3 討論

缺血再灌注損傷是腦卒中的一個主要合并癥，研究顯示腦缺血由兩部分組成：低氧和血管反應。其中一個重要的血管反應即腦水腫，是腦缺血后導致中樞神經系統損傷，破壞血腦屏障進而產生。在腦缺血后復雜的病理損傷機制中，炎癥反應、氧化應激是IR 損傷的主要原因，是目前神經科學研究的熱點，抗氧化應激、減輕炎癥損傷成為治療缺血性腦血管病的主要途徑之一。目前對于IR 損傷并無特效藥，通過神經功能評估和病理檢測可表明0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草水煎液對IR 損傷具有良好的保護作用，且古籍《品匯精要》“治中風失音不語，口眼歪斜，時吐涎沫”及《本草蒙筌》“療暴中風行邪，口眼喎斜者立效”均表明豨薟草對腦卒中具有良好的療效，但對豨薟草抗IR損傷研究較少。因此本文基于PI3K/Akt 信號通路探討其抗IR 損傷的作用機制。

PI3K/Akt 通路已被確定為調節細胞增殖、生長和血管生成重要參與者的主要信號通路之一，可減少炎癥基因的誘導，在IR 損傷的炎癥反應中起著重要的作用。近年來，針對PI3K/Akt 信號軸為靶點的藥物開發也越來越受到關注，研究表明川芎嗪可通過PI3K/Akt 信號通路緩解IR 損傷；珠子參皂苷能通過調節PI3K/Akt 信號軸抑制線粒體介導的凋亡，防止腦缺血細胞凋亡；小檗堿可通過激活PI3K/Akt 信號通路減少炎癥從而降低IR 損傷，這些均表明PI3K/Akt 信號軸在腦缺血中的重要作用。本研究發現0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草水煎液可顯著降低PI3K和Akt mRNA 的表達，同時顯著降低PI3K 和Akt 蛋白的表達，表明豨薟草水煎液可能是以PI3K/Akt 信號軸為靶點的抗IR 損傷候選藥物，這種作用可能是通過抗炎發揮作用的。

NF-κB 在調節機體免疫反應中具有重要作用，也是參與炎癥反應最重要的蛋白質之一，其在IR 損傷的炎癥反應中的作用已有報道。在本研究中觀察到IR損傷后NF-κB、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量上升，但這些參與炎癥的因子在0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨薟草水煎液組均下調，表明豨薟草水煎液具有抗炎作用，能減輕IR 損傷所致炎癥反應。另外，研究表明TNFα 在炎癥性疾病中發揮重要作用，可通過刺激NF-κB的產生而加重卒中大鼠的IR 損傷，并可通過增加血管通透性，增加血腦屏障的損傷，引起腦水腫。本研究中，豨薟草水煎液的神經保護作用可能是通過下調NF-κB 和TNF-α 的含量發揮抗炎作用實現。

綜上所述，豨薟草水煎液抗IR 損傷可能是通過調節PI3K/Akt 信號通路抑制NF-κB、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量得以實現的。本研究是在動物體內進行的，因此，今后有必要在臨床條件下評價豨薟草對腦卒中患者的療效。