三代頭孢對老年心衰合并肺部感染患者腸道菌群的短期影響

陳曉婉 毛玉娣 喬華雙 黃海燕 丁西平

腸道菌群不僅可以分解食物從中獲取營養(yǎng)物質(zhì)和能量，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和介導(dǎo)免疫，還可以通過生成生物活性信號分子以維持人體的正常生理功能[1]。健康的腸道菌群可以保護(hù)機(jī)體免受外界致病微生物的入侵，而腸道菌群種類和結(jié)構(gòu)的失調(diào)，可能會對人體的胃腸道、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等產(chǎn)生一系列影響。由于各臟器功能衰退，較高比例的老年人患有心力衰竭等慢性疾病，而肺部感染既能誘發(fā)心衰又能通過增加心臟耗氧量進(jìn)一步加重心肌損害，因此該類患者通常需要使用抗菌藥物予以治療。

第三代頭孢類抗菌藥物憑借其抗菌譜覆蓋廣泛、藥物濃度高、藥效穩(wěn)定、安全性高等優(yōu)勢于臨床應(yīng)用較多，有相關(guān)實驗證明第三代頭孢類抗菌藥物的應(yīng)用可以有效改善心力衰竭合并肺部感染患者的臨床癥狀[2]，但老年人腸道菌群結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，更容易受到藥物和環(huán)境的影響，且有研究發(fā)現(xiàn)短期使用抗生素治療可將腸道微生物群轉(zhuǎn)變?yōu)殚L期替代的不健康狀態(tài)[3]，這都將影響患者的病情及治療效果。本研究選取住院期間應(yīng)用第三代頭孢類抗菌藥物治療的老年心衰合并肺部感染患者，分析其短期使用第三代頭孢類抗菌藥物前后腸道菌群的變化，重點了解其對菌群改變的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年12月-2021年5月在本醫(yī)院住院期間使用第三代頭孢類抗菌藥物治療的老年明確診斷心衰合并肺部感染的患者7例，包括男性4例，年齡66～89歲，平均（79.50±9.88）歲；女性3例，年齡73～82歲，平均（77.33±4.51）歲。患者的基本信息及第三代頭孢菌素類抗菌藥物使用情況見表1。

表1 患者基本信息及第三代頭孢菌素類抗菌藥物使用情況

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) ①納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時肺部CT提示肺部感染，痰培養(yǎng)提示細(xì)菌感染；年齡≥60歲；在院期間靜脈應(yīng)用第三代頭孢類抗菌藥物，且使用時間≥5天。②排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重肝腎功能損害；存在腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等；存在腦梗死、腦出血等腦血管疾病及精神系統(tǒng)疾病；存在慢阻肺、肺結(jié)核、膿氣胸等其他肺部疾病；存在慢性胃腸炎、炎癥性腸病等消化系統(tǒng)疾病；近期有腹瀉、便秘等胃腸道癥狀；近1個月有抗生素、益生菌等用藥史；對第三代頭孢類抗菌藥物過敏或者存在禁忌。

1.3 糞便標(biāo)本的采集 糞便標(biāo)本采集：在受試者使用第三代頭孢類抗菌藥物第0、3、5天使用采樣器各采集1次新鮮糞便樣本，單次1～3 g，標(biāo)序列放置于-80 ℃冰箱里保存。

1.4 糞便標(biāo)本的DNA提取和16s基因組測序 ①DNA提取：利用CTAB或SDS法提取糞便樣本中的DNA，提取成功后用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA純度和濃度，DNA濃度用無菌水稀釋至1 ng/uL。②PCR擴(kuò) 增 及16S DNA測 序：提 取 后的DNA，選用特異性引物16S V4區(qū)段（341F-806R（F：CCTAYGGGRBGCASCAG，806R：GGACTACNNGGGTATCAAT）進(jìn)行擴(kuò)增，均采用New England Biolabs公司的15Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，包括：98 ℃下初始變性1 min，然后在98 ℃下變性10 s，在50 ℃下退火30 s，在72 ℃下延伸30 s，最后在72 ℃下延伸5 min。所得的PCR產(chǎn)物使用Qiagen, Germany的Qiagen Gel Extraction Kit，在2% 瓊 脂 糖 凝膠上進(jìn)行電泳檢測，最后使用Illumina, USA的TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit生成測序文庫，經(jīng)采用 Qubit@2.0 Fluorometer（Thermo Scientific）和Agilent Bioanalyzer 2100評估合格后，使用Illumina NovaSeq platform進(jìn)行測序。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用F檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組比較采用Z檢驗；計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 α多樣性變化 使用Shannon指數(shù)、Faith's PD指數(shù)、Chao1指數(shù)分析老年心衰合并肺部感染患者使用第三代頭孢類抗菌藥物后腸道菌群α多樣性變化，本研究發(fā)現(xiàn)使用第三代頭孢類抗菌藥物第3天后患者腸道菌群多樣性改變無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)，Shannon指數(shù)（P=0.081）、Chao1指數(shù)（P=0.310）、Faith's PD指數(shù)（P=0.176），但在使用第5天后腸道菌群多樣性較使用前明顯下降（P＜0.05)。Shannon指 數(shù)（P=0.018）、Chao1指 數(shù)（P=0.028）、Faith's PD指數(shù)（P=0.018），見 表2。

表2 各時間段患者腸道菌群α多樣性指數(shù)

2.2 各水平上腸道菌群系序列數(shù)及豐度的改變

2.2.1 門水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)改變 本研究中主要序列為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門及放線菌門。其中使用第三代頭孢類抗菌藥物第5天后門水平上可見擬桿菌門序列數(shù)下降（P＜0.05），厚壁菌門、變形菌門、放線菌門序列數(shù)改變方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 使用第三代頭孢類抗菌藥物第5天腸道菌群門水平序列數(shù)

2.2.2 綱水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)改變 使用第三代頭孢類抗菌藥物第5天后綱水平上可見擬桿菌綱序列數(shù)下降（P＜0.05），芽孢桿菌綱、y-變形菌綱、梭狀芽孢桿菌綱、放線菌綱、疣微菌綱序列數(shù)改變方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 使用第三代頭孢類抗菌藥物第5天腸道菌群綱水平序列數(shù)

2.2.3 屬水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)改變 使用第三代頭孢類抗菌藥物第5天后屬水平上可見酪酸梭狀芽孢桿菌屬、盲腸羅氏菌屬、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬、瘤胃球菌002屬、瘤胃球菌005屬序列數(shù)下降（P＜0.05），擬桿菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬序列數(shù)改變方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

3 討 論

心衰合并肺部感染是老年人常見疾病之一，且死亡風(fēng)險極高，早期抗生素的使用至關(guān)重要。第三代頭孢類抗菌藥物主要通過抑制細(xì)胞壁的合成達(dá)到殺菌的效果，遠(yuǎn)強(qiáng)于前兩代，對革蘭陰性桿菌及厭氧菌均有較強(qiáng)的作用。國內(nèi)外許多研究均表明第三代頭孢類抗菌藥物治療過程中腸道菌群結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變[5]，甚至可以通過腸道黏膜免疫促進(jìn)心力衰竭的發(fā)展[6]，因此早期動態(tài)監(jiān)測使用第三代頭孢類抗菌藥物使用前后的腸道菌群變化，可以有助于我們使用藥物合理干預(yù)。本研究通過檢測第三代頭孢類抗菌藥物治療前后的老年心衰合并肺部感染患者腸道菌群短期變化，發(fā)現(xiàn)治療后患者腸道菌群α多樣性下降，擬桿菌門豐度下降，擬桿菌綱豐度下降，酪酸梭狀芽孢桿菌屬、盲腸羅氏菌屬、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬、瘤胃球菌002屬、瘤胃球菌005屬豐度下降。

本研究中短期使用第三代頭孢類抗菌藥物后老年心衰患者腸道菌群的多樣性下降，且在使用第5天后較前顯著降低，這說明第三代頭孢類抗菌藥物短期使用即可引起腸道菌群的改變，且為漸進(jìn)性的改變，與Yang Lulu等[7]研究數(shù)據(jù)相同。但定義腸道菌群多樣性改變的好壞，需要聯(lián)合菌群數(shù)量和種類的改變分析比較。在本研究中使用第三代頭孢類抗菌藥物第5天后腸道菌群門水平上主要是擬桿菌門減少，厚壁菌門未見明顯改變，與相關(guān)研究結(jié)果相同[8]。擬桿菌門是腸道中的優(yōu)勢菌，為革蘭陰性厭氧菌，其減少提示了腸道優(yōu)勢菌屬的改變及腸道菌群結(jié)構(gòu)的失調(diào)，而同樣在本研究中，由于擬桿菌門的大量減少，短期使用第三代頭孢類抗菌藥物后患者腸道菌群中厚壁菌門/擬桿菌門比值升高。有研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門/擬桿菌門比值升高可以導(dǎo)致炎癥性腸病等相關(guān)疾病的發(fā)生[1]。

本研究發(fā)現(xiàn)短期使用第三代頭孢類抗菌藥物第5天后屬水平結(jié)構(gòu)變化更為明顯，主要是酪酸梭狀芽孢桿菌屬、盲腸羅氏菌屬、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬、瘤胃球菌002屬、瘤胃球菌005屬下降，提示了第三代頭孢類抗菌藥物短期使用主要是抑制老年心衰合并肺部感染患者腸道菌群的增殖。酪酸梭狀芽孢桿菌屬、盲腸羅氏菌屬及瘤胃球菌屬均可以產(chǎn)生以丁酸為主的多種短鏈脂肪酸，這些短鏈脂肪酸可以提供能量，維持腸道酸性環(huán)境，但第三代頭孢類抗菌藥物的使用使其數(shù)量減少，這可能會導(dǎo)致滲透性腹瀉及某些腸炎的發(fā)生[9]，補(bǔ)充相應(yīng)的膳食纖維或可改善腸道菌群的組成和功能。本研究中發(fā)現(xiàn)的如酪酸芽孢桿菌屬的減少或許可以通過益生菌及益生元補(bǔ)充，從而保護(hù)和修復(fù)腸道黏膜屏障，維持腸道功能，同樣益生菌可減輕心肌肥厚和心臟重塑，延緩心力衰竭的發(fā)展[10]，使用第三代頭孢類抗菌藥物的同時使用益生菌益生元制品無論是對腸道菌群還是對心力衰竭均有益處，但本研究中腸球菌屬、雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬并未有明顯變化，國內(nèi)外其結(jié)果差異較大，這可能與研究樣本量過少，抗生素應(yīng)用差異以及患者飲食生活習(xí)慣有關(guān)。

本次研究采用16S rRNA高通量測序更加深入比較短期使用第三代頭孢類抗菌藥物對此類患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，但本研究樣本量較少，且抗生素選擇不一致，后續(xù)仍需加大樣本量，進(jìn)一步研究隨訪單一抗生素對腸道菌群的影響，期待大樣本、多中心、多時間點的研究進(jìn)行。

綜上所述，短期應(yīng)用第三代頭孢菌類抗菌藥物可引起老年心衰合并肺部感染患者腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，主要表現(xiàn)為產(chǎn)生短鏈脂肪酸的有益菌屬減少，這可以幫助我們更好地參與老年心力衰竭合并肺部感染患者的診治并加以干預(yù)。