水質苯胺類化合物測定方法驗證分析

宋 偉

（上海威正測試技術有限公司，上海 201612）

1 標準方法簡介與原理

水質 苯胺類化合物的測定氣相色譜-質譜法HJ 822—2017[1～2]方法簡介：該方法主要適用地表水、地下水、海水、生活污水和工業廢水中苯胺類化合物的測定。其中包括苯胺、2-氯苯胺、3-氯苯胺、4-氯苯胺、3，4-二氯苯胺、2，4，6-三氯苯胺、2，4，5-三氯苯胺、2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-氯-2-硝基苯胺、2，6-二氯-4-硝基苯胺、2-溴-6-氯-4-硝基苯胺、2-氯-4，6-二硝基苯胺、2，6-二溴-4-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺、2-溴-4，6-二硝基苯胺、4-溴苯胺。當樣品取樣量為1L，經過濃縮后體積1.0mL 時，該方法檢出限為0.05～0.09μg/L，測定下限為0.20～0.36μg/L。

方法原理：水樣中的苯胺類化合物在pH ≥11堿性條件下用二氯甲烷進行萃取，萃取液經過脫水、濃縮、凈化等條件后，用氣相色譜-質譜儀測定。根據目標化合物的保留時間和標準質譜圖或特征離子進行定性，用內標法定量。

2 儀器設備和試劑材料

島津氣相質譜聯用儀GC-QP2010plus、色譜柱：RTX-5MS 30m×0.25mm，0.25μm 膜厚毛細管柱、氮吹儀及K-D 濃縮瓶、帶真空泵固相萃取裝置、弗羅里硅土層析柱、康氏振蕩器、微量注射器、1L 帶聚四氟乙烯塞分液漏斗、砂芯漏斗、容量瓶以及一般實驗室常用儀器和設備。

二次蒸餾水、二氯甲烷（農殘級）、異丙醇（農殘級）、正己烷（農殘級）、甲醇（農殘級）、硫代硫酸鈉、經400 ℃烘烤4h 后氯化鈉和無水硫酸鈉、氫氧化鈉：濃度為10moL/L、硫酸溶液1∶1。苯胺類化合物標準貯備溶液、替代物（苯胺-d5）標準貯備溶液、內標（1，2-二氯苯-d4、菲-d10）貯備液、氦氣等。

3 標準方法中存在的問題

3.1 實驗中存在問題

實驗過程前期沒有很好解讀該標準，在操作實驗過程中，會出現一些問題，如萃取過程中分液漏斗塞子不嚴密導致水樣的損失；實際水樣加入氯化鈉，經氫氧化鈉溶液調節至pH ≥11，加入二氯甲烷后，經振搖后可能會出現乳化現象。

3.2 標準給的參考條件不滿足實際工作需求

通過實驗后所得到的洗脫液，按照標準所給的氣相的條件：進樣口溫度260℃；進樣方式是不分流模式；載氣氦氣；進樣量1μL；從40℃開始保持5min，以5℃/min 升溫到100℃，以10℃/min 升溫到200℃保持8min，再以30℃/min 升溫到280℃，質譜的條件：離子源：EI 源，離子源溫度：230℃；掃描方式scan；掃描范圍m/z35～500amu；掃描時間1s/scan；接口溫度260℃；經過儀器檢測，根據出峰時間、最低檢出限因子響應、和出峰總時間等因素，不滿足實際工作需求。

4 針對方法存在的問題的改進

4.1 完善驗證方法流程

首先制定好驗證方法計劃，然后依據標準對實驗室情況進行分析調研，看實驗室是否能達到實驗所需要求。對于調研過程中發現的不符合的地方及時進行改進，缺少的試劑、耗材燈及時申請購買。然后邀請有經驗的老師進行技術方面的培訓指導，碰到技術問題采用一問一答并記錄到內部培訓記錄及評價表。接下來進行方法的實驗驗證（包括標準曲線的驗證、方法檢出限的驗證、方法精密度的驗證、方法準確度的驗證等）。最后出具一份模擬報告，并撰寫新檢測項目計劃表、新檢測項目調研報告、內部培訓記錄及評價表、新檢測項目驗證報告、新檢測項目評審報告、新檢測項目作業指導書。

4.2 解決實驗過程存在的問題

通過解讀標準和技術培訓，更了解了實驗前準備工作和實驗中標準的操作步驟，針對分液漏斗有漏液現象，解決方案：按照分液漏斗檢漏操作規范，首先關閉分液漏斗頸部旋塞，向分液漏斗內注入適量的蒸餾水，觀察旋塞的兩端以及漏斗的下口處是否漏水，若不漏水，關閉上磨口塞，左手握住旋塞，右手食指摁住上磨口塞，倒立，檢查是否漏水，若不漏水，正立，將上磨口塞旋轉180°，倒立，若不漏水，則此分液漏斗可以使用。在萃取過程中，當加入二氯甲烷振蕩步驟中，會出現乳化現象；解決方案：經過大量實驗嘗試，在加入氯化鈉、不停的攪拌、把乳化液進行超聲，破乳效果不明顯；離心分離法和冷凍法效果明顯，但是冷凍法操作過程中需要冷凍時間和解凍時間，比較耗時，不太適用實際工作中；最終選用將乳化液放入離心機進行離心，條件設為：5 000r/min，時間設置3min；可根據實際水樣進行調節。

4.3 優化儀器條件

首先按照標準參考條件進行進樣分析，通過每次進樣分析，逐步對該條件進行優化（主要考慮出峰時間，最低檢出限目標因子的響應以及總運行時間）。

氣相色譜條件：

色譜柱：RTX-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為氦氣，氣相色譜條件：進樣口溫度260℃，進樣方式為不分流進樣，進樣量1.0μL，柱流量1.0mL/min（恒流）升溫程序從40℃開始保持5min，以5℃/min 升溫到100℃，以10℃/min 升溫到200℃保持8min，再以30℃/min 升溫到280℃，運行時間，37.67min。

質譜儀條件：

掃描方式：全掃描；掃描范圍35～500amu；電子轟擊源EI，離子源溫度230℃；接口溫度260 ℃；溶劑延遲10min。

5 實驗數據處理與討論

5.1 標準曲線的繪制

取6個2mL 容量瓶，預先加入少量二氯甲烷，然后向其中分別準確移取8μL、20μL、40μL、80μL、120μL、200μL 濃度為50μg/mL 的苯胺類化合物標準使用液（含替代物），再準確移取40μL 內標使用液至2.0mL 容量瓶中，混勻，并用二氯甲烷定容至2.0mL，配制成苯胺類化合物和替代物質量濃度分別為0.20μg/L、0.50μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L、3.00μg/L、5.00μg/mL，內標1 物質量濃度為1.60μg/mL，內標2質量濃度為0.08μg/mL 的標準系列，貯存在棕色小瓶中，于冷暗處存放。

將配制好的標準溶液系列，按照儀器分析條件（4.3）依次從低濃度到高濃度進行測定，以目標化合物濃度與內標化合物濃度的比值為橫坐標，以目標化合物定量離子的響應值與內標化合物定量離子響應值的比值為縱坐標，繪制標準曲線，見表1。

從表1得出結論：19種苯胺類化合物及其替代物的線性相關系數均滿足標準要求的R≥0.995，故校準曲線線性符合要求。

表1 苯胺類化合物（含替代物）的校準曲線線性

5.2 檢出限

根據HJ 168—2010環境監測分析方法標準技術導則附錄A 中A.1的方法檢出限要求，按空白實驗加標檢測目標物質的方法，重復n=7次的加標實驗，將各測定結果換算成樣品的濃度和含量，計算7次平行測定的標準偏差，按公式（1）計算方法檢出限。

式中：MDL 為方法檢出限；N為樣品平行測定次數；t為自由度為n-1，置信度為99%時的t分布（單側）；Sb為n次平行測定的標準偏差。

結論：通過加標值除以方法檢出限的數值，以及HJ 168～2010環境監測技術導則判定原則：對于針對多組分的分析方法，一般至少要求50%的被分析物樣品濃度在3～5倍計算出的方法檢出限的范圍內，同時，至少90%的被分析物樣品濃度在1～10倍計算出的方法檢出限的范圍內，其余不多于10%的被分析物樣品濃度不應超過20倍計算出的方法檢出限，符合標準要求，（且本次驗證的各個目標化合物的方法檢出限均符合少于或等于HJ 822-2017 標準上的對應物質檢出限）因此本次驗證的方法檢出限合格。

5.3 精密度

對空白樣品進行加標，理論上樣品中苯胺類化合物為0.50、2.00、5.00μg/L，每種濃度分別平行測定6次得到的精密度結果。

結論：19種苯胺類化合物及其替代物的高、中、低樣品濃度平行測定6次相對標準偏差在1.1%～9.7%之間，小于30%，精密度滿足要求。

5.4 準確度

對空白水樣進行加標；理論上樣品中苯胺類化合物濃度為0.50μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L，每種濃度分別平行測定6次得到的準確度結果。

對任務單號21010201，21010202，21010203 分別為地下水、地表水、廢水樣品進行加標，理論樣品苯胺類化合物濃度為0.20μg/L、2.50μg/L、4.50μg/L，每種濃度分別平行測定6次得到的準確度結果。

結論：空白水樣進行加標，19種苯胺化合物及其替代物的高中低三種加標水平下的的空白水樣加標平均回收率在72.8%～95.9%，實際水樣進行加標，19種苯胺化合物及其替代物的高中低三種加標水平下的的實際水樣加標平均回收率在58.7%～81.1%之間，地表水、地下水回收率均在50%～150%，廢水回收率均在40%～150%，替代物回收率均在50%～150%，滿足分析要求。

6 方法驗證結論

本實驗室在儀器設備、環境條件、人員能力、標準物質及試劑驗收等方面均具備了水質苯胺類化合物的測定能力；方法驗收方面，本實驗室所得精密度，準確度及最低檢出限均達到HJ 822—2017 對水質苯胺類化合物的測定要求，綜合考慮，本實驗室可以開展此項目。