五味子及其內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展

黃楊竹，石悅煒，張艷梅，權(quán)春善，金黎明

(大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)隸屬于八角目木蘭科五味子屬植物，《新修本草》中有記錄，五味子果肉、果皮甘甜微酸，果核味辛苦，果實(shí)整體帶有咸味，因而得名五味子[1]。五味子產(chǎn)地主要以黃河為界分成南、北兩大產(chǎn)區(qū)，北五味子主產(chǎn)于遼寧丹東、本溪地區(qū)；南五味子主要分布在長江岸線及中國西南部。作為中國傳統(tǒng)藥用植物的五味子最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有主補(bǔ)益精氣、治療咳嗽、喘息、過勞體傷的功效，因此常用于肝膽氣虛、頭暈、失眠、乏力等癥狀。五味子中發(fā)揮藥理作用的化學(xué)成分主要是多糖類、木脂素類、揮發(fā)油類、三萜化合物以及有機(jī)酸等[2]。現(xiàn)代研究顯示五味子具有降低血糖、保肝護(hù)肝及促進(jìn)機(jī)體免疫的作用，在心血管類疾病、呼吸系統(tǒng)類疾病、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，是優(yōu)質(zhì)藥品、食品、調(diào)味品的重要原料[3]。由于五味子顯著的藥用和保健功效，其野生資源慘遭大肆采挖，現(xiàn)在已然成為國家三級重點(diǎn)保護(hù)藥用植物品種。隨著野生藥用植物資源的減少，其內(nèi)生菌因具有易于發(fā)現(xiàn)新化合物、易于擴(kuò)大培養(yǎng)、不受季節(jié)限制等優(yōu)勢而日漸引人矚目。

植物內(nèi)生菌是指存活于健康植物體組織中，不會引起宿主產(chǎn)生病害癥狀或侵染現(xiàn)象，甚至?xí)λ拗饔幸娴奈⑸颷4]。藥用植物的內(nèi)生菌會與宿主植物共同或分別產(chǎn)生一些有藥用價(jià)值的物質(zhì)，如抗病菌、抗腫瘤、抗氧化等活性成分，這些物質(zhì)可直接成為優(yōu)質(zhì)藥用資源，或經(jīng)過誘導(dǎo)而催生的次級代謝物成為植物藥用成分的一部分[5]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，藥用植物都含有內(nèi)生菌，長時間的協(xié)同進(jìn)化使得內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主結(jié)構(gòu)功能相同或相仿的代謝物質(zhì)[6]。與內(nèi)生菌共生的藥用植物會生成更多的活性物質(zhì)，究其原因可能是內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝物質(zhì)能夠刺激宿主生成特定產(chǎn)物，或宿主生成藥理物質(zhì)的關(guān)鍵酶[7]。內(nèi)生菌的存在可以協(xié)助宿主植物提高抗逆能力，也可以促進(jìn)植物對土壤中各種營養(yǎng)元素的吸收，同時也會通過產(chǎn)生植物激素加快宿主植物的生長發(fā)育[8]。基于宿主植物和內(nèi)生菌間的相互作用關(guān)系，以及微生物繁殖快、培養(yǎng)易于控制、成本低等優(yōu)勢，藥用植物內(nèi)生菌成為尋求藥理活性成分的理想資源。近年來，在對五味子藥理成分需求逐漸加大的情況下，加快對五味子內(nèi)生菌的研究將從一定程度上緩解五味子植物資源短缺的問題。

1 五味子內(nèi)生菌的種類

五味子內(nèi)生菌主要種類具體情況見表1。

表1 五味子內(nèi)生菌種類詳情

1.1 五味子內(nèi)生真菌及其種類

在五味子內(nèi)生菌中，內(nèi)生真菌的含量比較豐富，學(xué)者的相關(guān)研究也較為深入。GAO[9]從產(chǎn)地為湖北恩施的五味子根系中分離得到一株內(nèi)生真菌，為鏈格孢屬(Alternariasp.)，能夠產(chǎn)生一定的抗性藥物。趙玥等[10]在對遼寧地區(qū)野生北五味子內(nèi)生真菌的分離研究中，純化得到23株內(nèi)生真菌，植株根部的內(nèi)生真菌含量豐富。鄭春英等[11]從五味子植株中果實(shí)、根莖和藤莖部位分離得到26株內(nèi)生真菌，其中青霉菌(Penicilliumsp.)9株、曲霉菌(Aspergillussp.)12株、毛霉菌(Mucorsp.)2株以及其他種屬3株，它們對常見的致病菌都有一定的抑制效果。張譽(yù)薺等[12]從三年生北五味子植株種子中分離得到4株真菌，經(jīng)過鑒定分別屬于為青霉菌、擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)等，其中被鑒定為青霉菌的WZ3代謝產(chǎn)物對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制性。

1.2 五味子內(nèi)生細(xì)菌及其種類

對五味子內(nèi)生細(xì)菌的研究沒有內(nèi)生真菌的范圍廣，但分離出細(xì)菌株數(shù)也較為可觀。曹聰?shù)萚13]從小興安嶺地區(qū)北五味子果實(shí)中分離純化得到31個屬的內(nèi)生細(xì)菌，其中最多的是藍(lán)藻門細(xì)菌，占總獲得內(nèi)生細(xì)菌總量的88.19%。徐麗等[14]從健康五味子植株的根部分離出了大量內(nèi)生細(xì)菌，總計(jì)322株，其中來自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)藥材基地的內(nèi)生細(xì)菌占比最大，約為47.5%。篩選出322株中對五味子莖基腐病菌、人參銹腐病菌和穿山龍黑斑病菌有拮抗作用的3株內(nèi)生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)它們分別屬于黃假單胞菌(Pseudomonassynxantha)、沙雷氏菌(Serratiagrimesii)和蒙氏單胞菌(Pseudomonasmonasmonteilii)。金巖等[15]從五味子植株的根、莖、葉中分離純化得到了302株內(nèi)生細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)植株根部的內(nèi)生細(xì)菌含量和存活率是最高的，其次是莖，含量最低的部位是葉片。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得出約有24.19%的內(nèi)生細(xì)菌對植物致病菌有較好的拮抗作用，不同來源的五味子內(nèi)生細(xì)菌的拮抗能力存在差異。

2 五味子及其內(nèi)生菌中的活性成分

2.1 木脂素類

木脂素是一類天然化合物，屬于植物雌激素，大部分呈游離狀態(tài)，少部分結(jié)合為糖苷儲存于植物的樹脂中。木脂素可以保護(hù)植物不受微生物和食草動物的傷害，還具有抗腫瘤、保護(hù)肝臟、保護(hù)中樞神經(jīng)、抗氧化、抗病毒等生物活性。在五味子植株中，木脂素類活性成分含量最多，高達(dá)8%。關(guān)于木脂素生物合成的現(xiàn)有資料顯示，參與該成分合成代謝的關(guān)鍵酶有苯丙氨酸解氨酶、香豆酸-3-羥化酶、松脂醇-落葉松酯酚還原酶、肉桂醇脫氫酶、蛋白氧化酶[16-17]。許哲祥等[18]從野生五味子中分離得到內(nèi)生真菌WJ1，通過其發(fā)酵而得到的木脂素含量明顯高于生藥五味子的含量，其中五味子醇甲的含量比生藥五味子含量高2倍左右，五味子甲素增加率不低于25%。毛瑞華[19]從金山五味子內(nèi)生真菌毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)中通過液態(tài)發(fā)酵得到4種木脂素產(chǎn)物，后續(xù)又從其須根部位內(nèi)生菌中通過固態(tài)發(fā)酵得到2種木脂素產(chǎn)物。

2.2 揮發(fā)油類

五味子中揮發(fā)油主要存在于植物的果實(shí)、種子、葉片和莖等部位，其主要成分是萜類化合物，如單萜類、倍半萜類等，還含有少量的酸和醇。五味子中揮發(fā)油成分能夠增強(qiáng)機(jī)體的防御能力和應(yīng)激反應(yīng)能力，也可以起到調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)的作用，該成分能夠促進(jìn)DNA的合成以及提高淋巴細(xì)胞的增生而達(dá)到加強(qiáng)免疫力的效果[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，北五味子油具有抑制α-糖苷酶的作用，降低餐后血糖峰值，提高胰島素的敏感性，保護(hù)胰腺。五味子油還可以通過升高超氧化物歧化酶(SOD)減少脂肪過氧化并提升葡萄糖的被轉(zhuǎn)運(yùn)能力，增強(qiáng)胰島素的分泌[21]。程敏等[22]利用響應(yīng)面法，得到超臨界二氧化碳萃取五味子揮發(fā)油類的最優(yōu)條件：萃取壓力33 MPa，萃取溫度53 ℃，萃取90 min，CO2流量21.40 mL·min-1，該條件對種子油的提取率為8%。周玲等[23]通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法得到五味子揮發(fā)油最佳提取條件：液固比為10，浸泡4.3 h，提取時間5.5 h，該條件可得五味子揮發(fā)油0.013 mL·g-1。對于五味子果實(shí)中揮發(fā)油類，崔九成等[24]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析出30個物質(zhì)，經(jīng)鑒定其中α-檀香烯含量高達(dá)14.30%；β-雪松烯含量為12.30%；γ-杜松帖烯含量占總油量的12.79%，由此可看出五味子揮發(fā)油中主要是倍半萜類化合物。鮑英杰等[25]發(fā)現(xiàn)選用乙二醇低共熔溶劑萃取(DES)得到的五味子油有較好的抗氧化能力，且黏性較低便于操作。

2.3 多糖類

五味子中富含多糖類物質(zhì)，總多糖含量約占8%，其粗糖類成分有護(hù)肝、抗氧化、益膽、抗疲勞等功效，在降血糖以及治療糖尿病方面作用也較為明顯，Jin等[26]發(fā)現(xiàn)，五味子多糖上調(diào)了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(GLUT-4)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(P-AMPK)等蛋白質(zhì)的表達(dá)量水平，表明該成分可以利用腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和胰島素信號通路減少葡萄糖的消耗。高曉旭等[27]揭示了多糖具有降低糖尿病模型小鼠的體重以及控制血糖升降的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)五味子多糖可以改善D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠腦萎縮，并提高腦衰老小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[28]。五味子淡紫擬青霉菌(Paecilomyceslilacinus)內(nèi)生真菌的糖苷類代謝產(chǎn)物3-亞甲基0-β-D-吡喃葡萄糖基-1,2-二酚，也具有抗細(xì)菌和抗腫瘤的能力[29]，該物質(zhì)對金黃色葡萄球菌有良好的抑制效用，同時也能抑制單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌。苗昊等[30]的研究顯示五味子多糖可以通過抑制卵巢癌細(xì)胞自噬作用，加強(qiáng)癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急凋亡程度，從而抑制癌細(xì)胞的生長。

2.4 其他類化合物

五味子及其內(nèi)生菌中的次級代謝產(chǎn)物除了常見的木脂素類、揮發(fā)油類和多糖類之外，還有一些罕見的物質(zhì)被研究者提取出來。張萍等[31]從北五味子果實(shí)的內(nèi)生細(xì)菌WF17發(fā)酵液中分離得到原兒茶酸成分，是一類存在于植物中的酚酸物質(zhì)，多從冬青科植物葉片中獲得，具有抗腫瘤、抗致病菌和抗氧化的活性，在臨床上被用來治療慢性氣管炎等疾病。沈瑋蕓[32]在狹葉南五味子中分離得到293株內(nèi)生真菌，其中一株被鑒定為青霉菌，在該真菌的發(fā)酵液內(nèi)確定得到了12種三萜化合物；在另一株被鑒定為哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的真菌發(fā)酵液中分離得到尼哥納樂酸，是一種三萜酸，可抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，促進(jìn)腦源性神經(jīng)因子的表達(dá)，在神經(jīng)病理中有廣闊的應(yīng)用前景。目前對五味子中有機(jī)酸的研究較少，但其有機(jī)酸含量豐富，包含檸檬酸、蘋果酸、丁二酸等。

3 五味子及其內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的藥理作用

3.1 抗菌作用

研究者盡管在抗生素發(fā)掘方面取得了較大進(jìn)步，但疾病的發(fā)生和發(fā)展以及耐藥性仍是醫(yī)學(xué)界的大問題，因此從藥用植物中探索出新的抗菌性活性成分依舊是醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)。與其他藥用植物一樣，五味子中也存在許多抗菌性物質(zhì)。劉月月等[33]采用水煎法加入3倍五味子重量的蒸餾水浸泡1 h后煮30 min，制作得到濃縮五味子水提物，分別對大腸桿菌、藤黃微球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該水提物對它們均有抑制作用，且對革蘭氏陰性菌的抑制性較為強(qiáng)烈。林雄平等[34]利用乙醇和水提取南五味子根部的黃酮類物質(zhì)有較好的抑菌作用，醇提法對南五味子根部的黃酮類物質(zhì)的提取率比水提法高5.87%，且醇提法所得物質(zhì)對啤酒酵母、黑曲霉都有抑制作用，對黑曲霉的效果最佳。林雄平等[35]還發(fā)現(xiàn)南五味子老根、幼根、老莖、幼莖、葉的乙醇提取效率不相同，對葉片的提取率達(dá)到17.44%，猜測可能是葉片中存在著許多生化途徑和儲藏了大量營養(yǎng)物質(zhì)所致。除幼莖的提取物質(zhì)對枯草芽孢桿菌無抑菌效果外，其余部位的提取物都對測試菌有較為可觀的抑制效果。用五味子中提取的木脂素處理大腸桿菌后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的細(xì)胞壁受損，木脂素使得細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂導(dǎo)致了自身的裂解，從而達(dá)到了抗菌效果[36]。部分研究者對五味子抗菌成分及其作用機(jī)制的探討見表2。

表2 五味子抗菌成分及其作用機(jī)制

3.2 抗腫瘤作用

中藥抗腫瘤作用已經(jīng)是現(xiàn)今研究界的熱門方向，譬如青蒿琥酯可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖；川陳皮素能夠通過一系列反應(yīng)將細(xì)胞阻礙于G1期；槲皮素可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的死亡；大黃素甲醚通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)信號導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡和自噬等[41]。中華傳統(tǒng)藥用植物的抗腫瘤活性成分受到越來越多的關(guān)注，五味子中能夠被用于腫瘤治療的有效成分主要是木脂素、三萜化合物和多糖類，各成分作用機(jī)制見表3。有研究者在對非小細(xì)胞肺癌的治療實(shí)驗(yàn)中采用了五味子甲素和表皮細(xì)胞生長因子(EGF)受體抑制劑結(jié)合處理癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)五味子甲素可以刺激肺癌細(xì)胞對藥物的敏感性，從而肺癌細(xì)胞被誘導(dǎo)周期停滯甚至凋亡[42]。

表3 五味子抗腫瘤成分及其作用機(jī)制

3.3 抗氧化作用

人類機(jī)體因?yàn)檠趸饔枚a(chǎn)生的氧化自由基不穩(wěn)定，會毀傷機(jī)體，引起衰老和慢性疾病。在生物進(jìn)化過程中出現(xiàn)了一套完整的保護(hù)體系清除多余的氧自由基，現(xiàn)在對中藥的研究成果也表明自然界擁有能夠抗氧化的活性物質(zhì)，例如五味子中的木脂素。馬瑩慧等[49]將五味子木脂素中的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇乙與等濃度維生素C相比較測定其抗氧化能力，結(jié)果得出五味子木脂素成分有較好的抗氧化能力，能夠清除超氧陰離子自由基。五味子抗氧化成分及其作用機(jī)制見表4。

表4 五味子抗氧化成分及其作用機(jī)制

3.4 其他藥理作用

五味子的生物活性成分對肝病的治療作用較好，臨床研究發(fā)現(xiàn)五味子對肝纖維化、病毒性肝炎、肝癌等病癥有較好的預(yù)防和治療效果。Chen等[56]研究發(fā)現(xiàn)五味子乙素能夠通過對CCl4誘導(dǎo)進(jìn)行體內(nèi)肝纖維化治療，該成分可以改善肝功能、減少膠原蛋白的沉積，經(jīng)過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路預(yù)防肝纖維化的進(jìn)展。也有研究發(fā)現(xiàn)[57]五味子多糖和木脂素對酒精和乙酰氨基酚引起的小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用，因?yàn)榫凭珪?dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)異常，加上過量乙酰氨基酚處理后機(jī)體會出現(xiàn)肝臟抗氧化能力弱，誘發(fā)肝細(xì)胞的損壞，而五味子多糖和木脂素都有抗氧化的功能，能夠保肝護(hù)肝。五味子的有效活性成分在動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果中表現(xiàn)出提高小鼠的學(xué)習(xí)能力、減少神經(jīng)元衰老和保護(hù)中樞神經(jīng)的功效。肖飛等[58]的研究表明五味子醇甲可以提高中樞神經(jīng)細(xì)胞的活性，預(yù)防疾病效應(yīng)優(yōu)于治療作用，一定程度上也能減少中樞神經(jīng)細(xì)胞的損傷。五味子己烷提取物可以通過內(nèi)皮依賴性一氧化氮(NO)途徑引起血管舒張，以及肌球蛋白輕鏈(MLC)去磷酸化直接作用于血管平滑肌細(xì)胞，從而維持心血管的舒張[59]。五味子其他藥理作用及其作用機(jī)制見表5。

表5 五味子其他藥理作用及其作用機(jī)制

4 結(jié) 語

中國可入藥的植物種類非常豐富，其中也不乏充足的內(nèi)生菌資源。近年來研究者們對五味子及其內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)五味子的內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌都會產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的有效成分，這為大批量、快速度獲得目的藥理成分提供了可能。藥用植物五味子中的主要有效活性成分有木脂素、三萜化合物、揮發(fā)油類以及有機(jī)酸和多糖類，而且從五味子內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物中還分離出了五味子植株未發(fā)現(xiàn)的活性成分。其中，五味子木脂素的可應(yīng)用范圍最為廣泛，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病菌的作用，對心血管疾病、肝病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病都有預(yù)防和治療的效用。