梯度營養稀釋法篩選貧營養凈水微生物的研究

邱錦鳴，吳佳佳，劉 哲，薛陳杰，劉雪梅

（淮陰工學院化學工程學院，江蘇 淮安 223003）

貧營養微生物又稱寡營養微生物，大部分生長在有機質匱乏的環境中，如土壤、湖泊河水、地下水、沙表土等地。將貧營養微生物從環境中分離提取出來，用于自來水工藝中低濃度溶解性污染物的去除，這是近年來在給水處理領域形成的一個新思路。目前，在貧營養凈水微生物篩選方面已經取得了一定的進展。從不同介質中篩選的高效貧營養細菌在碳、氮營養元素去除方面均展現了良好的性能［1-3］。由于貧營養細菌增殖速度較慢，擴大化培養成為貧營養微生物凈水技術應用的重要制約因素。部分國內外學者開展了貧營養微生物富集培養方法的相關研究，已見報道的技術方法包括滅絕稀釋培養法、擴散箱培養法以及各種不可培養細菌的富集方法［4-6］。然而，現有成果大多局限于實驗室內，距離規模化生產、使用還有一定差距。

兼性營養細菌既能在貧營養基上培養，也能在富營養環境下生長，易于擴大化培養。本研究采用梯度營養稀釋法進行貧營養微生物的篩選，從而獲得兼性貧營養凈水菌株，有效克服貧營養凈水微生物難以富集培養的難題。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集淮安市二河水源地水樣和表層底泥。水樣用脫脂棉過濾，除去水中的懸浮物，得到有機質均一的水作為試驗用水；底泥溶于滅菌蒸餾水，搖勻后靜置，取上層清液，同樣經脫脂棉過濾后得到試驗用水。

1.2 培養基的制備

牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g和氯化鈉0.5 g溶解于100 mL無菌水中，得到富營養培養基，依次稀釋10倍、100倍、1 000倍和10 000倍，得到不同濃度水平的貧營養液態培養基。將瓊脂按1∶50加入液態培養基，制備固體培養基。

1.3 菌株的分離

利用平板劃線法在富營養培養基上劃線分離菌株，28℃培養。待長出群落后，不同形態菌落劃線分離，直到純化至單菌落為止。將純化后的菌株依次接種于10倍、100倍、1 000倍和10 000倍稀釋培養基中培養，留取在1 000倍和10 000倍的培養基中能夠生長的菌落，轉入斜面保存。

1.4 高效凈水兼性貧營養細菌的篩選

將經分離純化的兼性貧營養菌株接種到液態富營養培養基中，28℃200 r/min過夜培養，獲得含大量菌體的菌液。將菌液在5 000 r/min離心2 min，用滅菌蒸餾水洗滌3次，得到只含有菌體而無培養基的菌液。將富集培養的純化菌液接種到微污染水體以及無菌水中，投菌量保持在105～106cfu/mL，在28℃下靜置培養7 d。通過投菌前后總有機碳（TOC）的變化篩選高效凈水菌株。其中TOC采用紅外吸收法測定。

1.5 菌株鑒定

采用革蘭氏染色進行菌株形態和類別的識別。采用16SrDNA基因法對菌株進行分子鑒定。按照細菌DNA基因組提取試劑盒說明書提取分離菌的DNA作為PCR模板。PCR體系為上、下游引物和模板各1μL，ddH2O 22μL，2×Taq MasterMix 25μL，總體積為50μL。PCR擴增反應程序為94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個循環；72℃修復延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳純化擴增，送上海生工生物工程公司測序。測序結果在NCBI的BLAST分區檢索并比對分析，鑒定菌株類別。

1.6 菌株生長曲線的測定

采用光密度法測定菌株的生長曲線。將篩選出的高效貧營養細菌分別接種在富營養以及稀釋1 000倍和10 000倍的液態培養基中，28℃200 r/min搖床培養，測量不同時間菌液的光密度（OD），繪出各菌株在不同營養條件下的生長曲線。

1.7 菌株理化特性分析

對篩選出的菌株進行碳、氮營養元素利用特性、耐鹽性分析以及雙氧水和乙醇的抗性分析。碳源4 g、氮源1.2 g、磷源0.24 g以及200 mL無菌水配置液態培養基，按照“1.5”方法進行菌株接種，初始濃度保持106cfu/mL左右。調整碳源及氮源類別，比較培養基的渾濁程度來觀察菌體的生長情況。在液態培養基中添加不同濃度的氯化鈉、雙氧水以及乙醇，根據培養基的渾濁程度判斷菌株的耐鹽性、雙氧水抗性及乙醇抗性。

2 結果與分析

2.1 兼性凈水貧營養微生物的分離和篩選

2.1.1 兼性貧營養細菌的分離 本研究共分離出36種細菌，其中從水樣中分離出15種細菌，編號分別為A1～A15，從底泥中分離出21種細菌，編號分別為B1～B21。將分離出的菌株依次接種到貧營養培養基上培養，得到8株兼性貧營養細菌，分別為A3、A5、A6、A9、A10、B2、B4、B6。

2.1.2 高效貧營養細菌的篩選 選取水源地微污染水體，初始TOC濃度為25.06 mg/L。分別向水體中投放8種兼性貧營養細菌，同時設置2份未投加菌株的水樣作為空白對照。每日測定TOC濃度。TOC濃度變化曲線和7日降解率分別見圖1和圖2。

圖1 投放凈水菌株后微污染水體TOC濃度變化曲線

由圖1、圖2可知，菌株投加后，均可不同程度地降低水體中TOC的濃度，且濃度下降趨勢逐步趨緩。未加入菌株的空白對照組TOC也有一定程度的下降，分別為19.52%、25.81%，推測是水體本身含有的微生物發揮的凈水效應。在8組菌株投加的水樣中，除B2組，其他7個組別第7日TOC濃度均低于空白組。處理效果相對較好的是A6和A9，降解率分別達71.52%和63.80%。該降解率與顧祖宜［7］及田興華［8］篩選的高效營養凈水微生物對有機碳的降解率大體相當。

圖2 不同菌株所在微污染水體中TOC的7日降解率

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的形態特征 菌株經革蘭氏染色后，在油鏡下觀測各菌株形態如圖3所示。從圖3可以看出，A6和A9均為革蘭氏陽性菌。就外觀形態而言，A6近似球狀，A9為桿狀。

圖3 高效兼性凈水貧營養細菌的油鏡觀測

2.2.2 菌株分子鑒定 用16SrDNA基因法對該菌株進行鑒定。本試驗提取了A6和A9的基因組DNA，通過PCR擴增后DNA的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖4所示，2個菌株的DNA抽提效果較好，條帶單一，清晰明亮，A6大小位于Marker 1 kb和3 kb條帶之間，A9位于Marker 0.5 kb和1 kb條帶之間。

圖4 菌株DNA凝膠電泳

篩選出的高效凈水細菌分別為短小芽孢桿菌（Bacilluspumlus）和蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus）。由于芽孢桿菌具有極強的生命力，能在惡劣的環境中利用有機質，其作為微生物凈水劑已經在污染處理、養殖水體凈化中得到應用［9，10］。本研究凈水試驗表明，短小芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌TOC的降解率也高于其他菌株。

2.3 菌株生長特性曲線

由生長曲線（圖5）可以看出，無論是短小芽孢桿菌還是蠟狀芽孢桿菌，其對數期啟動均隨著培養基濃度的降低而呈滯后趨勢，光密度最大值隨著培養基濃度的降低而依次減小。其中，短小芽孢桿菌在富營養、稀釋1 000倍和稀釋10 000倍培養基中光密度最大值分別為4.51、2.71和1.39；而蠟狀芽孢桿菌在富營養、稀釋1 000倍和稀釋10 000倍培養基中的光密度最大值分別為3.86、1.45和1.11。由此可見，通過提高培養基的濃度水平，可以顯著提高兼性貧營養凈水微生物的富集效率。

圖5 短小芽孢桿菌（A）和蠟狀芽孢桿菌（B）在不同濃度培養基下的生長曲線

2.4 菌株理化特性分析

2.4.1 碳源利用特性分析 不同種類的微生物利用碳源的能力存在差別，微生物利用的碳源物質主要有糖類、有機酸、醇、脂類、烴及碳酸鹽等。選用凈水能力較好的A6和A9菌株進行多種碳源利用能力試驗，空白組中無碳源添加。恒溫搖床上過夜培養后出現渾濁，說明菌株有生長，能對相應碳源物質加以利用，未出現渾濁的，說明菌株無生長。從表1可以看出，A6和A9菌株無法在無碳源和碳酸鈉作為碳源的情況下生存，可在葡萄糖和乙醇的環境下生存。A9無法利用甲醇作為碳源生長，而A6則可以利用甲醇生長。

表1 菌株對碳源物質的利用

2.4.2 氮源利用特性分析 試驗選取作為氮源的物質有NH4Cl、（NH4）2SO4、KNO3和肌苷。從表2可以看出，A6和A9株菌無法在無氮源的情況下生存，可在NH4Cl、（NH4）2SO4、KNO3等作為氮源的培養基中生長，說明2種菌株都可以利用自然界中的硝態氮和銨態氮等無機氮。此外，A6也可以利用肌苷作為氮源，而A9則不能利用肌苷作為氮源。

表2 菌株對氮源物質的利用

2.4.3 菌株耐鹽性試驗 對營養液中無機鹽的有無進行生長分析。從表3可以看出，當NaCl的濃度為0.5%時，2個菌株均生長良好。隨著NaCl濃度的升高，菌株生長狀況逐漸變差。當NaCl的濃度達3%時，A9菌株停止生長；當NaCl的濃度達5%時，A6菌株培養72 h仍未見生長。

表3 菌株對無機鹽的利用

2.4.4 菌株對雙氧水的抗性試驗 H2O2作為強氧化劑，可以產生能破壞細胞核酸、蛋白和磷脂的羥基自由基，從而達到殺菌的目的。用雙氧水對A6和A9菌株進行抗性試驗（表4），當雙氧水濃度為0.03%和0.3%時，A6和A9菌株均可以生長，當雙氧水濃度達3%時，2種菌株均難以生長。由此可見，濃度為3%的雙氧水可以破壞上述細菌的細胞核酸、蛋白質和磷脂等，從而達到殺菌的目的。

表4 H 2O2濃度對菌株生長情況的影響

2.4.5 菌株對乙醇的抗性試驗 75%乙醇是常用的皮膚消毒劑，它能溶解細胞脂類物質，同時也可以使蛋白質變性。本試驗采用不同體積分數的乙醇對菌株進行抗性試驗。從表5可知，較低體積分數的乙醇可以成為菌株的碳源。但是當體積分數達10%時，乙醇就會對菌株產生毒害作用，這可能與乙醇達到一定的體積分數會破壞細菌的蛋白質結構有關，導致菌株難以生長，從而起到殺菌的目的。

表5 乙醇體積分數對菌株生長情況的影響

3 結論

本研究采用梯度營養稀釋法從水源地水體及底泥中篩選兼性貧營養微生物。通過培養基接種試驗以及凈水試驗，篩選出2株高效的凈水貧營養微生物，分別為短小芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，兩者對TOC的7日去除率分別達71.52%、63.80%。生長曲線試驗表明，提高培養基的濃度可以顯著提高細菌的富集效率。理化特性分析表明，2種兼性貧營養細菌生長均利用多種碳源和氮源，但在具體種類上存在一定差別，表明使用多種凈水微生物復配可能優于單一微生物菌株的使用。耐鹽及抗性試驗表明，高鹽環境對微生物生長具有一定抑制作用，濃度為3%的雙氧水和體積分數為10%的乙醇均能將A6和A9殺死，因此2種菌株能安全地用于自來水凈水工藝中。