丹參“水—脂”二元組分凝膠的皮膚藥動學研究

何金英 張永萍 曹國瓊 劉耀 徐劍

微透析技術(microdialysis，MD)是將模擬血管的半透膜探針以微創方式植入組織中，采用與細胞外液相近的溶液為灌流液，利用膜內外濃度差收集細胞外液中內源性物質或藥物的采樣方法[1-2]。具有損傷輕微、動態監測、采樣量小等優點[3-4]，廣泛應用于皮膚、腦、血液、關節等局部藥動學研究。微透析收集到的透析液中藥物濃度只是探針周圍藥物實際濃度的一部分并非組織或靶器官內該成分的真實濃度，需要通過回收率對待測部位實際濃度進行校正[5]，而取樣過程中，灌流流速、藥物質量濃度等都影響著探針的回收率，因此，微透析方法的建立尤為重要。

丹參為唇形科鼠尾草植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖，具有活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰的功效，主治胸痹心痛，脘腹脅痛，癥瘕積聚，熱痹疼痛，心煩不眠，月經不調，痛經經閉，瘡瘍腫痛等[6-7]。其主要的化學成分有水溶性成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、原兒茶醛，脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮IIA等[8]。臨床常見的制劑如口服復方丹參滴丸、復方丹參片等易發生首過效應，且對腸胃刺激及副作用大，吸收緩慢，生物利用度較低；而靜脈注射丹參酮注射液時可出現過敏反應，安全性低[9]。丹參制劑經皮吸收能克服以上這些缺點，近年來丹參經皮給藥制劑[10-12]有穴位透皮貼劑、冠心巴布劑、凝膠劑等用于冠心病及特異性皮炎的治療。

因此，本文旨在建立丹參“水—脂”二元組分皮膚微透析方法，考察灌流流速、藥物質量濃度對丹參“水—脂”二元組分皮膚探針回收率的影響，考察其體內外回收率的穩定性，對丹參“水—脂”二元組分凝膠的皮膚藥動學進行研究。

1 材料與儀器

1.1 實驗藥物、試劑與儀器

迷迭香酸對照品(批號:111871-201706，質量分數≥98.0%)、紫草酸對照品(批號：111871-201706，質量分數≥98.0%)、隱丹參酮對照品(批號：111871-201706，質量分數≥99.0%)、丹參酮IIA(批號：111871-201706，質量分數≥98.0%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。丹酚酸B對照品(樂美天醫藥德思特生物，批號：DST190918-009，質量分數≥98.0%)、乙腈(色譜級，安徽天地高純溶劑有限公司，批號：21085231)，無水乙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：Q/12HB3995-2017)，烏拉坦(上海源葉有限公司，批號S16GS161476，98%)，生理鹽水(貴州科倫藥業有限公司，批號：E120092301)，聚乙二醇-400(西隴科學股份有限公司，批號：Q/STXH119-2014)，PBS(pH=7.2～7.4)緩沖溶液等。

超高效液相色譜儀(Waters公司)、十萬分之一電子分析天平；瑞典CMA微透析系統：CMA30微量注射器推進泵、MAB85冷卻收集器及CMA30線性探針(膜長1 cm，截留分子量6000Da，全長30 cm，瑞典CMA公司)。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質量250～300 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2019-0014。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH Shied RPC18(1.7μm，2.1×50 mm)；流動相：0.1%甲酸水(A)：乙腈(B)，進行梯度洗脫(0～3分鐘，7～10%B；3～5分鐘，10～16%B；5～25分鐘，16～30%B；25～38分鐘，30～54%B；38～51分鐘，54%B；51～55分鐘，54～7%B)，柱溫30℃，進樣量10 μL，檢測波長270 nm。

2.2 對照品的配制

精密稱取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B加灌流液(pH=5，PBS溶液)超聲溶解溶解并定容至50 mL容量瓶中；隱丹參酮與丹參酮ⅡA加灌流液[3](無水乙醇∶PEG400∶生理鹽水=5∶2∶3)超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中即可。

2.3 專屬性實驗

按“2.1”項下的色譜條件丹參水溶性對照品及脂溶性對照品進樣，取兩種灌流液直接進樣分析，另取經皮微透析空白接收液進樣分析，結果見圖1。

2.4 標準曲線的繪制

將丹參水溶性成分與脂溶性成分配制五個不同濃度，按“2.1”項下色譜條件分析，以質量濃度為(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，并求出回歸方程。結果表明丹參“水—脂”二元組分中五個成分的線性關系良好，r>0.999，如表1所示。

表1 丹參“水—脂”二元組分的線性關系考察結果(n=5)

2.5 微透析探針回收率和損失率的測定

2.5.1 增量法 將探針置于一定濃度標準液中，空白灌流液通過注射器推進泵以一定流速推進，帶出進入膜內的藥物,即可計算回收率，公式為：

R=Cd1/Cp1×100%

其中，Cd1表示透析液中藥物濃度，Cp1表示初始標準液濃度。

2.5.2 減量法 注射器推進泵中含有一定濃度的藥物作為灌流液，將探針置于空白灌流液中，探針內的藥物濃度通過膜的雙向擴散作用擴散到空白灌流液中，即可計算損失率，公式為：

L=(Cp2-Cd2)/Cp2×100%

其中，Cd2表示透析液中藥物濃度，Cp2表示灌流液中藥物濃度。

2.6 灌流液流速對探針體外回收率的影響

在37℃，300 r/分鐘條件下，利用增量法考察0.5、1.0、1.5 μL/分鐘三個流速對探針體外回收率的影響，每個流速收集5個樣(每個樣30 μL)，棄掉前2個樣,更換流速時必須平衡1小時后再收集樣品溶液。按照“2.1”下條件測定透析液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹參酮ⅡA及隱丹參酮的質量濃度，按“2.5”項下增量法公式計算回收率；如表2所示。顯示丹參水脂二元組分探針體外回收率隨著灌流液流速的增加而降低，但流速為0.5 μL/分鐘時，探針回收率最高，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮ⅡA的體外回收率分別為(58.60±1.48)%、(61.13±1.60)%、(58.17±0.30)%、(26.16±0.74)%、(24.66±1.37)%。因此選擇0.5 μL/分鐘的灌流速度，取樣時間間隔為60分鐘。

2.7 藥物質量濃度對探針體外回收率的影響

將五個成分配制為三個不同濃度(C1、C2、C3)的混標溶液，迷迭香酸(11.60、5.80、2.84 μg/mL)、紫草酸(34.60、17.30、8.5 μg/mL)、丹酚酸B(18.20、9.10、4.46 μg/mL)；隱丹參酮(31.40、12.56、6.28 μg/mL)及丹參酮ⅡA(28.80、11.52、5.76 μg/mL)，用增量法與減量法分別考察濃度對探針回收率的影響。每個濃度收集5個樣，棄掉前2個樣，時間間隔30分鐘,更換濃度時必須平衡1小時后再收集樣品溶液。按照“2.1”下條件測定透析液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮ⅡA的質量濃度，利用增量法與減量法計算回收率，如表3所示。結果顯示藥物質量濃度對探針回收率與損失率影響不大，且回收率與損失率近似相等，表明反透析法可以用于在體微透析實驗數據的校正。

2.8 體外回收率的日內穩定性研究

分別將迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮ⅡA配制成11.60、34.6、18.20、6.28、5.76 μg/mL；用減量法分別考察探針體外回收率24小時穩定性。按“2.5”項下增量法公式計算回收率，結果如圖2所示，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮ⅡA在24小時保持相對穩定，RSD%分別為6.33、4.10、5.91、2.20、4.49。

表2 不同流速對丹參“水—脂”二元組分回收率的影響

表3 水溶性藥物質量濃度對探針體外回收率與損失率的影響

圖2 丹參“水—脂”二元組分體外回收率的日內穩定性考察

2.9 體內回收率的日內穩定性研究

2.9.1 探針前處理 將探針置于0.1%的肝素鈉溶液中浸泡20分鐘，防止植入皮膚后凝血，堵塞半透膜，影響實驗。

2.9.2 動物處理與探針植入 實驗前一天剃去大鼠腹部毛，用脫毛膏去除細絨毛；用20%的烏來糖以1.2 g/kg腹腔注射麻醉后固定在鼠板上后，將引導針平行皮膚穿過真皮，植入點和終點距離2 cm，將探針導管從針頭穿入后退去引導針，移動探針半透膜至正中間，用醫用膠布固定植入點和終點，防止動物醒后破壞探針。

2.9.3 探針在體回收率的穩定性考察 分別將迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮ⅡA配制成11.60、34.6、18.20、6.28、5.76 μg/mL；用減量法分別考察探針在體回收率10小時穩定性。按“2.5”項下減量法公式計算回收率，結果如圖3所示，丹參水溶性成分與脂溶性成分在體回收率保持相對穩定。

3 皮膚局部藥動學

前處理同“2.9.1”和“2.9.2”項，實驗室自制丹參“水—脂”二元組分凝膠，給藥面積為2.5 cm×2.5 cm,以0.5 μL/分鐘，取樣時間間隔為1小時，持續12小時。采用DSA2.0軟件進行數據處理，使用非房室模型對皮膚組織中藥物濃度C與時間t數據進行擬合。主要藥動學參數見表4，藥物濃度—時間曲線見圖4。

圖3 丹參“水—脂”二元組分在

圖4 丹參“水—脂”二元組分凝膠經皮

表4 丹參“水—脂”二元組分凝膠經皮

3 討論

本實驗在體外考察了流速與藥物質量濃度對CMA30線性探針回收率的影響，確定了丹參“水—脂”二元組分微透析取樣的最佳流速為0.5 μL/分鐘，該流速下迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮 ⅡA的體外回收率分別為(58.60±1.48)%、(61.13±1.60)%、(58.17±0.3)%、(26.16±0.74)%、(24.66±1.37)%，通過增量法與減量法測定三個濃度對探針回收率與損失率影響不大，表明反透析法可以用于丹參凝膠經皮給藥局部藥動學實驗數據的校正，且體內外探針回收率保持相對穩定，建立了丹參“水—脂”二元組分皮膚在體微透析的方法。由表4藥動學參數結果表明，丹參“水—脂”二元組分凝膠透皮性能良好，但迷迭香酸、紫草酸未檢測到，其可能原因是濃度過低，透過皮膚濃度小。

探針回收率的影響因素有流速、灌流液的成分、藥物的理化性質等。因此灌流液通常是液細胞外液接近的溶液如生理鹽水、pH7.2～7.4的PBS溶液、林格試劑等，對于脂溶性大的藥物通常選擇含有一定濃度的乙醇生理鹽水溶液如30%乙醇生理鹽水，除此之外還可以加入其他增溶劑如PEG400。本研究選用pH=5的PBS溶液，因為丹酚酸B在pH=3～5的酸性溶液中保持穩定，隨著pH的增加，丹酚酸B含量會明顯下降[13]，pH對迷迭香酸及紫草酸無明顯影響。在整個實驗中保持避光，因為丹參酮ⅡA在溶液中對光及敏感，會發生光化反應，生成多種物質[14]。

本研究初次建立了丹參“水—脂”二元組分在SD大鼠皮膚微透析方法可為今后丹參經皮給藥制劑研究提供參考，也可以用于不同促滲方法對經皮給藥制劑的促滲作用研究，為丹參經皮給藥制劑藥動學—藥效學結合模型等相關研究奠定基礎。