益氣溫陽顆粒聯合貝伐珠單抗調控Lewis荷瘤小鼠腫瘤血管生成的實驗研究

劉偉 梁綿杰 姜可園 謝莉瑩 王雪玭 張笑雪

肺癌是目前世界已知患病率最高的癌癥之一[1]，世衛組織最新的權威數據顯示[2-3]，僅2020年全世界腫瘤患者就新增了1930萬例，死亡患者為1000萬例；其中肺癌分別為220萬(11.4%)和180萬(9%)，死亡患者數量居于榜首。縱觀全球，我國是新發肺癌最多的國家，約為82萬(17.9%)，占全球新發肺癌的37%，位居前列。隨著大氣污染和人口老齡化的加劇，肺癌的患病率逐年增加，至2025年預計中國肺癌發病人數將達到100萬/年[4]。肺癌不僅產生巨額醫療費用，更重要的是嚴重影響患者生活質量，故而尋求不同的肺癌的治療方案意義重大。

天津中醫藥大學孫增濤教授根據多年臨床經驗和實驗研究以益氣溫陽散瘀為法，創制出益氣溫陽顆粒用以治療肺部腫瘤，臨床上取得了一定的療效，在延緩腫瘤進展的同時，對于改善患者生存質量大有裨益。但因腫瘤的成因極為復雜，是多種因素共同影響的結果，故益氣溫陽顆粒具體的抗腫瘤機制目前尚不清楚。

自腫瘤依賴血管生成假說被Folkman等[5]人提出以來，便一直是學界的研究熱點。2004年美國FDA批準了貝伐珠單抗應用于臨床腫瘤治療，這是第一種運用于臨床的抗腫瘤血管生成藥物，其主要通過阻斷血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)結合，使得腫瘤血管生長受抑，從而達到控制腫瘤生長的目的。但近年臨床發現貝伐珠單抗存在包括異常出血[6]、蛋白尿[7]等在內的諸多不良反應，并且長期使用較易產生耐藥性。而中醫藥在控制腫瘤血管生成方面同樣存在著一定的優勢，且副作用小[8]。故本實驗通過檢測益氣溫陽顆粒聯合貝伐珠單抗對Lewis荷瘤小鼠腫瘤組織中反映微血管密度(microvessel density，MVD)的血小板—內皮細胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)，以及與腫瘤血管生成相關的VEGF、VEGFR-2的影響，探討益氣溫陽顆粒聯合貝伐珠單抗可能存在的抗腫瘤血管生成機制，以期為中西醫結合治療肺部腫瘤提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、瘤株

清潔級近交系C57BL/6J雄性小鼠40只，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：1100111911037746；小鼠Lewis肺癌瘤株，中國科學院上海生命科學研究院。本實驗通過中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物倫理委員會審核(編號：IRM-DWLL-2019140)。

1.2 實驗藥物

益氣溫陽顆粒由黃芪20 g、肉蓯蓉10 g、淫羊藿9 g、黨參15 g、薏苡仁20 g、雞內金9 g、桔梗9 g、莪術10 g、虎杖10 g、甘草6 g組成，由天津中醫藥大學第二附屬醫院中藥房提供；貝伐珠單抗注射液(安維汀)100 mg，規格：4 mL/瓶，購自Roche Pharma(Switzerland)Ltd.，批號：H0210B06。

1.3 實驗試劑與儀器

免疫組化試劑盒(批號：IHC003)、VEGFR-2一抗(批號：bs-10412R)、CD31一抗(批號：bsm-10825M)均購于北京博奧森生物技術有限公司；PCR試劑盒(批號：DRR420A)、超純RNA提取試劑(批號： D9108B)、反轉錄試劑盒(批號：DRRO47A)均購于寶生物工程(大連)有限公司。

顯微鏡(BX51T-PHD-J11，Olympus Corporation)，CMOS(UCMOS00350KPA，Olympus Corporation)，分光光度計(NANODROP 2000，Therno scientific)，熒光定量PCR儀(ABI7500，Applied Biosystems)，多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(Image-Pro Plus，Media Cybernetics)。

1.4 建立小鼠模型

取液氮保存的Lewis肺癌細胞系，用37℃水浴融化，加入RPMI1640培養液，37℃、5%CO2培養，傳代。再將培養后的Lewis細胞用胰蛋白酶消化，將細胞濃度調整為1×107個/mL的瘤細胞懸液。取40只小鼠，在每只小鼠右腋窩脫毛，消毒后，充分搖勻細胞液后皮下接種0.2 mL。5天后若可在接種部位觸及瘤體，即造模成功。

1.5 藥物制備

益氣溫陽顆粒用蒸餾水配制成含生藥0.1 g/mL的藥液，置于4℃冰箱中保存；貝伐珠單抗注射液經生理鹽水配制成含貝伐珠單抗濃度為0.4 mg/mL的藥液供小鼠實驗使用。

1.6 分組及給藥

將造模成功后的荷瘤小鼠隨機分為模型組、西藥組、中藥組及中西聯合用藥組，共4組，每組10只。小鼠的藥量計算方式據徐叔云主編的《藥理實驗方法學》第三版中“動物與人體的每千克體重劑量折算系數表”進行折算。具體給藥方式如下：模型組：每天灌胃生理鹽水0.4 mL，連續14天；西藥組(貝伐珠單抗)：貝伐珠單抗腹腔注射，15 mg/kg，每周2次，連續兩周；中藥組(益氣溫陽顆粒)：每天灌胃益氣溫陽顆粒20 g生藥/kg，連續14天；中西聯合用藥組(益氣溫陽顆粒+貝伐珠單抗)：每天灌胃益氣溫陽顆粒20 g生藥/kg，連續灌胃14天以及貝伐珠單抗腹腔注射，15 mg/kg，每周2次，連續兩周。

1.7 檢測抑瘤率

第14天給藥后2小時處死小鼠，將腫瘤組織取出后用生理鹽水漂洗干凈殘血，吸干水分，計算抑瘤率。

1.8 檢測指標

1.8.1 VEGF mRNA轉錄水平 RT-PCR法檢測VEGF mRNA轉錄水平，具體步驟嚴格按試劑盒所示進行。PCR引物序列由上海生物工程技術服務有限公司合成，詳見表1。

表1 引物序列

1.8.2 腫瘤組織VEGFR-2、CD31表達水平 通過陽性細胞計數百分比和細胞染色強度的綜合評價，對免疫組化反應進行分析，計算二者評分的乘積即為免疫組化評分，詳見表2。

表2 免疫組化評分標準

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 瘤重、抑瘤率

與模型組相比，藥物組瘤重均有下降，其中聯合用藥組最小，而中藥組腫瘤最大，且各藥物組中聯合用藥組抑瘤率最高，但差異均不顯著(P>0.05)。具體見表3。

表3 各組Lewis小鼠瘤重、抑瘤率的比較

2.2 VEGF基因表達

β-actin的擴增曲線、溶解曲線見圖1；VEGF的擴增曲線、溶解曲線見圖2。β-actin與VEGF擴增曲線均拐點清楚，指數期明顯，基線平且無上揚現象，整體平行性、重復性好，呈典型“S”型曲線，Ct值分別為：22～26和16～25；β-actin與VEGF的溶解曲線均為單峰，產物特異性高，峰值分別出現在84.73℃與86.69℃。

藥物組VEGF mRNA表達均顯著低于模型組(P<0.01)，聯合用藥組最低，并優于中藥組(P<0.01)，表明益氣溫陽顆粒和貝伐珠單抗均可顯著降低VEGF在小鼠腫瘤中的表達，且聯合用藥療效最好。具體見表4。

2.3 VEGFR-2、CD31表達

聯合用藥組與模型組比較，小鼠腫瘤組織VEGFR-2的表達顯著下降(P<0.01)，其它藥物組與模型組相比，均有下降，但差異比較無統計學意義(P>0.05)。與聯合用藥組相比，模型組、中藥組

圖1 β-actin擴增及溶解曲線

圖2 VEGF擴增及溶解曲線

表4 各組Lewis小鼠腫瘤組織中

CD31表達均有統計學差異(P<0.01，P<0.05)，其他治療組雖然均有下降，但無統計學差異(P>0.05)，表明益氣溫陽顆粒和貝伐珠單抗均可在一定程度上下調VEGFR-2、CD31的表達，且聯合用藥療效顯著而確切。具體見表5、圖3～4。

表5 各組Lewis小鼠腫瘤組織中VEGFR-2、 CD31免疫組化評分比較

注：A 模型組；B 西藥組；C 中藥組；D 聯合用藥組。

注：A 模型組；B 西藥組；C 中藥組；D 聯合用藥組。

3 討論

作為一種消耗性疾病，腫瘤的快速增殖需要大量營養支持，腫瘤血管生成就是其“掠奪”營養物質的主要方式之一，這也是癌癥患者身體狀況呈斷崖式下跌的主因。當腫瘤體積超過2 mm2后，在缺血缺氧條件的刺激下，腫瘤細胞、內皮細胞、巨噬細胞等生成大量VEGF，其與血管生成抑制因子之間的動態平衡被打破，使得腫瘤內部微血管野蠻生長。MVD是組織單位面積下的微血管數量，可以很好的反應腫瘤組織新血管生成、血運狀態以及腫瘤的生長情況[9]，而CD31是內皮細胞標志物的一種，對于新生血管具有特異性，可以很好反映組織中的MVD，廣泛應用于肺癌組織新血管生成情況的評價。

VEGF是目前發現功能性及專屬性最強的血管生成因子,多生成于血管周圍細胞，通過旁分泌的方式對內皮細胞起作用，作為一種特異性的有絲分裂原，其可以強效作用于內皮細胞，促進形成新血管，使得內皮細胞死亡減少，同時還可以提高血管通透性。研究表明，VEGF在肺部腫瘤組織(荷瘤小鼠細胞、人體肺癌組織等)中均呈高表達狀態[7]。作為VEGF的受體，VEGFR-2與VEGF的結合是VEGF表達的必要條件，故VEGFR-2也是影響血管生成的直接因素之一[10]。VEGFR-2是酪氨酸激酶受體的一種，特異性的表達于血管內皮細胞，有著極其強大的酪氨酸激酶活性。低氧條件下，VEGF與VEGFR-2相結合后被活化，使得內皮細胞分裂分化為管腔樣的結構，還能使PI3K/AKT通路激活，促使磷脂酰肌醇得以磷酸化，釋放磷鈣離子、蛋白酶C和第二信使，增加血管內皮細胞的分裂，減少凋亡，促進血管細胞解離，造成血管通透性上升，不僅使纖維蛋白原等蛋白質外露形成纖維凝膠，促進毛細血管生成，為腫瘤細胞的增殖提供血氧支持，還可以制造適合腫瘤轉移環境[11]。研究表明，在小鼠肺移植瘤中VEGF呈過表達狀態[12]，而通過阻斷VEGF的表達，腫瘤及其血管的生長均受到抑制[13-14]。綜上，VEGF/VEGFR-2血管生成通路是腫瘤增殖過程中重要環節。

課題組前期對肺癌及肺結節進行文獻[15-16]梳理后發現，中醫對肺癌的認識總為本虛標實，由古而今，變者甚微。其本虛者多以氣血陰陽立論，其標實者，則以痰、瘀為多。孫增濤教授則認為，肺癌正虛在于氣陽兩虛，邪盛在于瘀血為患，這也是腫瘤血管快速不規則增生而形成不成熟、無序紊亂小血管的內在原因：肺者主氣，司呼吸，是統御全身之宗氣形成的重要環節；氣者帥血，氣行則血行，肺病日久，清氣攝入不足，而宗氣合化失源，而致氣虛。一則無力助肺司呼吸，肺傷氣虛愈甚；二則助心行血乏源，不僅無力推動血液的運行，血流緩慢，瘀阻于局部，而且無力統攝血在脈道中循經而行，以致血運失常以妄行，二者共同造成腫瘤血管生長紊亂；同時血為氣之母，血液瘀阻、妄行，又進一步傷氣，形成惡性循環。且氣虛日久，陽氣必殃，陽氣虛則推動溫煦無力，血寒則凝，瘀于局部，瘤體乃成。故有專家研究認為，瘀血內結是腫瘤血管生成的病理變化[17]。本課題組前期對原發性肺癌的文獻統計發現，氣虛患者占比最多，可達35.42%[18]；同時，對于肺結節患者(包括惡性肺結節患者)的體質調查發現，在偏頗體質中，氣虛與陽虛所占比例最大，且貫穿惡性肺結節始終，這些發現均佐證了益氣溫陽法治療肺部腫瘤的合理性[19]。

益氣溫陽顆粒全方由黃芪、肉蓯蓉、淫羊藿、黨參、雞內金、莪術、虎杖、雞內金、桔梗、甘草組成，方中黃芪入肺、脾兩經，既補肺益氣，又培土生金，淫羊藿入腎經，補腎助陽，二者益氣溫陽，金水相生共為君藥；臣以黨參、雞內金補氣健脾益肺，肉蓯蓉溫腎補陽，以加強益氣溫陽之效；莪術破血行氣消癥，虎杖活血祛瘀止痛，雞內金健脾消積散結，三者為佐藥，共奏祛瘀消瘤之用；桔梗入肺且為舟楫，載藥上行，引諸藥，達病所，甘草則性和，藥中“國老”，調和諸藥，共為使藥。全方君臣佐使相配，以益氣溫陽為本，祛瘀散結為標，標本兼顧，同時補而不滯，祛邪而不傷正，在多年的臨床中療效顯著。現代研究表明，方中黃芪所含有的黃芪多糖可以通過下調VEGF表達抑制腫瘤血管的生長[20]；與黨參聯用后，可以明顯增強紫杉醇抑制腫瘤MVD的作用[21]；桔梗中提取的皂苷類組分也有著同樣的作用[22]；淫羊藿的主要血管活性成分淫羊藿甙[23]，莪術中提取的有效單體成分莪術醇[24]，以及虎杖中的白藜蘆醇均有下調VEGF的作用[25]。

本實驗表明，在益氣溫陽顆粒、貝伐珠單抗、益氣溫陽顆粒聯合貝伐珠單抗的干預下，與模型組相比，各用藥組VEGF mRNA在肺癌組織中的表達均可顯著性下降，聯合用藥尤佳；聯合用藥可以顯著下調小鼠腫瘤組織中的VEGFR-2、MVD(CD31)；VEGF、VEGFR-2、MVD的表達，且與瘤重呈正性相關。在腫瘤重量方面，各治療組與模型組相比，瘤重均有下降，其中聯合用藥組下降最為明顯，抑瘤率可高達26.97%，但未發現明顯的統計學意義。可能與藥量的使用、治療時間等方面的因素存在一定的關系，需要在后續的研究中深入探討。

綜上所述，益氣溫陽顆粒聯合貝伐珠單抗可以通過調控VEGF/VEGFR-2這一關鍵的血管生成通路，下調VEGF和VEGFR-2的表達，有效減少腫瘤新血管生成，同時使已形成的微血管衰亡，降低MVD，還能在一定程度上抑制肺部腫瘤生長，延緩肺癌進展。