華蟾素注射液對Burkitt’s 淋巴瘤細胞Raji體外增殖、凋亡及細胞周期的影響

何宇 王建勛 王佩佩 崔鑫銘 王利

據(jù)2020年全球癌癥報告數(shù)據(jù)顯示，2020年非霍奇金淋巴瘤全球男性估計新發(fā)病例占比為3%，女性為2.6%，男性多于女性[1]。Burkitt’s 淋巴瘤屬于非霍奇金淋巴瘤的一種，是一種侵襲性極強的 B 細胞淋巴瘤，多發(fā)生于兒童和成年人[2-3]，臨床上主要分為地域型、散發(fā)型和免疫缺陷相關型三種[4]，Burkitt's 淋巴瘤對化療藥物高度敏感，目前臨床治療仍以多藥化療為主，同時包括靶向治療、細胞免疫治療、局部放療、自體干細胞移植等[5-6]。

中醫(yī)古籍中并沒有淋巴瘤一稱，隨著時代的發(fā)展，醫(yī)療的進步，被現(xiàn)代中醫(yī)學家歸為“惡核”“痰核”“陰疽”等范疇，主要表現(xiàn)在“痰、毒、瘀、滯、虛”五個方面[7]，病因病機與邪毒、痰凝等有關，治療應以解毒散瘀為原則[8-9]。蟾蜍，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》[10]中便有記載：“蟆，味辛、寒，主邪氣，破堅血，癰腫，陰瘡，服之不患熱病。”《本草綱目》記載：“蟾蜍，辛、涼、微毒，最良治一切五疳八痢，腫毒，破傷風病，脫肛。”華蟾素注射液便是從蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍等蟾蜍干皮經(jīng)水提醇沉方法得到的水溶性提取物[11]，再加工成注射用滅菌水溶液，具有清熱解毒、化瘀潰堅、利水消腫等作用。被廣泛用于肝癌、肺癌、胃癌等多種中晚期惡性腫瘤的治療，但華蟾素注射液對于Burkitt’s淋巴瘤治療方面少有研究。Raji細胞株于1963年首次從一個11歲小男孩左上頜骨Burkitt’s淋巴瘤中分離而得到的，為B細胞起源，是Burkitt’s淋巴瘤藥理學研究的理想選擇。基于實驗室前期研究方案與方法[12]，因此本實驗擬通過觀察和檢測不同濃度華蟾素注射液對Burkitt’s淋巴瘤細胞Raji的生物學影響，探討華蟾素注射液在治療Burkitt’s淋巴瘤方面的作用效果及相關機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人Burkitt's 淋巴瘤Raji細胞株(美國ATCC細胞庫，編號：CCL-86)；華蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批號：211201)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國CORNING公司，批號：34320006)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號：2084568P)；1×PBS(美國Gibco公司，批號：8119312)；細胞增殖檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)(江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20211210)；膜聯(lián)蛋白—異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒(北京金普來生物科技有限公司，批號：09001); PI/RNase Staining Buffer Solution細胞周期檢測試劑(美國BD公司，批號：1228040)。

生物安全柜(美國Thermo Scientific，型號：1300 SERUES A2)；小型臺式離心機(德國 Eppendorf，型號：5424R)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific，型號： HERAcell 150i)；倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS，型號：CKX53)；細胞計數(shù)儀(美國invitrogen，型號：Countess Ⅱ)；自動酶標儀(美國MolecμLar Devices，型號：SpectraMax i3x)；流式細胞儀 (美國BD，型號：FACSCantoⅡ)；IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析儀(美國Essen Bioscience，型號：IncuCyte S3)。

1.2 細胞培養(yǎng)

Raji細胞以5×105個/mL接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于飽和濕度、37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待其密度達到70%～90%時需要傳代，每2～3天傳代1次。

1.3 CCK-8法檢測華蟾素注射液對Raji細胞增殖的影響

收集處于對數(shù)生長期的Raji細胞，每孔4×104個(90 μL)接種于96孔板，各設6個復孔，同時設置空白孔(僅含培養(yǎng)基)及對照孔(含有Raji細胞及培養(yǎng)基)，將華蟾素注射液用10% FBS-RPMI-1640培養(yǎng)基進行稀釋，分別為原濃度的1/10、1/20、1/40、1/50、1/100、1/200、1/400，各取10 μL加入至對應實驗孔內(nèi)，總體系100 μL，邊緣孔用無菌的PBS溶液進行填充，于飽和濕度、37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12小時、24小時、48小時后，盡量避光的條件下加入10 μL CCK-8檢測溶液，輕輕振蕩混勻，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1.5小時,酶標儀波長設置為450 nm，在此波長處讀取各孔的吸光度(OD值)，并計算各組細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)× 100%。

1.4 IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測華蟾素注射液對Raji細胞增殖的影響

在實驗室前期研究[12]基礎上，本實驗首次采用IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析系統(tǒng)對細胞生長狀態(tài)進行動態(tài)監(jiān)測與記錄。該系統(tǒng)的優(yōu)勢在于不僅可以實時記錄活細胞的生長狀態(tài)，還可以在成像的同時進行定量分析，記錄影響細胞生物學行為的關鍵時間點等。

根據(jù)1.4實驗結果，取處于對數(shù)生長期的Raji細胞，每孔以1×104個(90 μL)的密度接種于96孔板，各設4個復孔，實驗組加入10 μL華蟾素注射液稀釋液(1/10、1/20、1/40、1/50、1/100、1/200、1/400)，總體系100 μL，空白對照組加入10 μL培養(yǎng)基，實時監(jiān)測24小時，每隔2 小時拍照一次；以每孔0 h 0 m的匯合度為標準，觀察細胞生長情況。

1.5 流式細胞檢測華蟾素注射液Raji細胞周期及細胞凋亡的影響

根據(jù)1.4實驗結果，取處于對數(shù)生長期的Raji細胞，每孔以1×106個的密度接種于6孔板，各設4個復孔，選取濃度為原液濃度的1/20、1/50、1/200、1/400的華蟾素稀釋液作用于Raji細胞24小時，24小時后顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。(1)細胞周期實驗組：收集細胞于15 mL離心管內(nèi)，預冷的PBS清洗細胞1次，在渦旋條件下，逐滴加入預冷的70%乙醇1 mL，輕輕吹打混勻，在-20 ℃條件下固定過夜，過夜后離心棄上清，預冷的PBS清洗細胞1次，再使用300 μL PI/RNase Staining Buffer對細胞進行染色, 室溫條件下，避光孵育15分鐘,用 40 μm濾網(wǎng)過濾細胞至流式管內(nèi),1小時內(nèi)上流式細胞儀檢測;(2)細胞凋亡實驗組：收集細胞于2 mL離心管內(nèi)，預冷的PBS清洗細胞1次，加入 100 μL結合緩沖液重懸細胞，每孔加入5 μL Annexin V-FITC抗體；混勻后室溫條件下避光孵育15分鐘，可在搖床上慢搖加速染色；15分鐘后加入10 μL PI；流式上機前在反應管中加入100 μL結合緩沖液終止染色，用 40 μm 濾網(wǎng)過濾細胞，1小時內(nèi)進行流式細胞檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 華蟾素注射液對Raji細胞增殖的影響

不同濃度華蟾素注射液作用于Raji細胞后，12小時、24小時、48小時存活率明顯低于空白對照組(1/400實驗組的12小時和48小時除外)，并且華蟾素注射液濃度越高，Raji細胞存活率越低，說明抑制率越高，但抑制率與作用時間無明顯依賴性，見表1。

2.2 IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測華蟾素注射液對Raji細胞增殖的影響

IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測華蟾素注射液對Raji細胞增殖實驗中，不同濃度華蟾素注射液作用于Raji 細胞24小時后，以每孔0 h 0 m的匯合度為標準，通過匯合度變化曲線得出，實驗組華蟾素1/10、1/20、1/40、1/50、1/100、1/200、1/400稀釋組可明顯抑制Raji細胞的增殖，且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖1～2，表2。

2.3 華蟾素注射液對Raji細胞周期及凋亡的影響

參考2.1結果，Raji細胞在為原液濃度1/20、1/50、1/200、1/400的華蟾素注射液24小時作用后，通過流式檢測其細胞周期及凋亡率的變化情況。結果顯示，華蟾素注射液可以增加Raji細胞 G0/G1和S 期的比例，降低G2/M期比例，阻止細胞進入G2/M期，見圖3，表3；未經(jīng)華蟾素注射液處理的Raji細胞自然凋亡率較低，為 (12.65±0.65)%，而經(jīng)過1/20、1/50、1/200、1/400華蟾素注射液處理24小時后，Raji細胞凋亡率明顯升高，分別為(48.15±1.50)%、(33.50±1.51)%、(27.77±1.66)%、(14.72±0.43)%，說明華蟾素注射液能明顯誘導Raji細胞的凋亡，且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖4，表4。

表1 華蟾素注射液對Raji細胞增殖的影響

注：A 空白對照組0 h 0 m細胞成像圖；B 空白對照組24 h 0 m細胞成像圖；C 華蟾素1/20 稀釋組0 h 0 m細胞成像圖；D 華蟾素1/20 稀釋組24 h 0 m細胞成像圖；E 華蟾素1/200 稀釋組0 h 0 m細胞成像圖；F 華蟾素1/200 稀釋組24 h 0 m細胞成像圖。

注：以每孔0 h 0 m匯合度為標準，IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析系統(tǒng)獲取的各組匯合度變化曲線。

表2 IncuCyte實時動態(tài)細胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測不同稀釋倍數(shù)華蟾素注射液對Raji細胞增殖的影響

表3 不同稀釋倍數(shù)華蟾素注射液對Raji細胞周期的影響

注： 橫坐標代表Annexin V-FITC，縱坐標代表PI；Q1代表損傷或壞死細胞，Q2代表晚期凋亡的Raji細胞，Q3代表Raji活細胞，Q4代表早期凋亡的Raji細胞。

表4 不同稀釋倍數(shù)華蟾素注射液 對Raji細胞凋亡的影響

3 討論

《中醫(yī)大辭典》中記載：“蟾蜍，辛，涼，有毒，有解毒消腫、止痛、利尿的功效。”蟾蜍作為我國傳統(tǒng)的抗腫瘤中藥材，因其藥效顯著而被廣泛研究。華蟾素注射液作為中國自行研發(fā)制作的中藥二類新藥，自上世紀80年代上市至今，在臨床應用已有40余年[13]，華蟾素注射液化學成分較為復雜，截至目前已分離獲得單體化合物超過100種[14]，主要包括蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類、小分子肽類、生物堿類及有機酸類等[15]。多項研究表明，蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯和吲哚生物堿兩大類具有抗腫瘤的作用[16]。大量臨床研究表明，華蟾素注射液與化療藥物聯(lián)用可有效降低化療藥物的不良反應，安全性較好，可提高患者的生活質(zhì)量[17-19]。

現(xiàn)代藥理學研究表明，華蟾素注射液可通過誘導細胞凋亡對肝癌、肺癌、胃癌等多種實體瘤發(fā)揮抑制作用[17，19-21]。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，能有效地清除機體內(nèi)受損的細胞。細胞凋亡的失調(diào)不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，而且與腫瘤對治療的抵抗有關[22]。根據(jù)先前的研究結果，華蟾素注射液一方面可通過調(diào)控肝癌細胞中Bcl-2/Bax和Fas/Fas L的表達，誘導細胞啟動凋亡程序，抑制肝癌細胞的增殖[23]；還可通過調(diào)控miR-106a-5p/STRT3信號通路促進凋亡發(fā)生[24]。本實驗中，CCK-8法、IncuCyte活細胞成像以及流式檢測均發(fā)現(xiàn)，華蟾素注射液可有效抑制Raji細胞的增殖，促進其凋亡，且藥物濃度越高，作用效果越明顯。并且首次應用IncuCyte動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)還直接觀察到，在華蟾素注射液干預6小時后，Raji細胞的增殖明顯受限，圖像顯示細胞呈皺縮狀態(tài)。

細胞周期由一系列的檢驗點控制，當DNA出現(xiàn)損傷時，可激活相關的檢驗點蛋白，從而導致細胞周期的延遲或阻滯[25]，細胞周期的異常可直接影響腫瘤細胞的增殖與分化。Han Y等[26]研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素聯(lián)合吉非替尼可將A549細胞周期阻滯于S期。張霞等[27]實驗表明，華蟾素注射液可阻滯Hep G2肝癌細胞于G0/G1期。本實驗中，流式檢測及分析發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，不同濃度華蟾素注射液可阻滯Raji細胞周期于G0/G1期和S期，表明華蟾素注射液可能通過抑制Raji細胞周期發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上，本研究首次證實華蟾素注射液可抑制Burkitt's 淋巴瘤Raji細胞的增殖，促進其凋亡，阻滯細胞于G0/G1期和S期，發(fā)揮其抗腫瘤作用，為臨床治療Burkitt's 淋巴瘤提供新的思路及客觀的體外實驗依據(jù)。后續(xù)研究可針對華蟾素注射液單體成分的作用效果、對Raji細胞凋亡和細胞周期相關蛋白表達及信號通路的影響進行研究，進一步明確華蟾素注射液治療Burkitt's 淋巴瘤的作用機制。