基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大補(bǔ)元煎治療阿爾茨海默病的機(jī)制

付高爽 孫慶玲 時(shí)晶 魏明清 李婷 田金洲

阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)多發(fā)于老年人，是癡呆最常見的病因，約占癡呆病例的60%～80%,其表現(xiàn)為思維、記憶、語(yǔ)言能力下降以及性格、行為改變。隨著疾病進(jìn)展，患者逐漸喪失執(zhí)行簡(jiǎn)單日常事務(wù)的能力，并最終導(dǎo)致死亡[1]。2018年的數(shù)據(jù)顯示全球有5000萬(wàn)人患有癡呆，預(yù)計(jì)2030年達(dá)到8200萬(wàn)人，2050年將翻3倍達(dá)到1.52億人[2]。AD不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也給家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)和照料負(fù)擔(dān)，但目前用于治療AD的藥物均無(wú)法減緩或阻止神經(jīng)元損傷導(dǎo)致的臨床癥狀及其致命性。

AD屬于中醫(yī)“呆病”范疇，大補(bǔ)元煎出自《景岳全書》，由人參、熟地黃、山藥、杜仲、當(dāng)歸、山茱萸、枸杞子、甘草8味中藥組成，可治療呆病元?dú)獯筇撜摺，F(xiàn)代研究表明，大補(bǔ)元煎可改善AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶功能，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、調(diào)節(jié)突觸可塑性、誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程記憶、減輕氧化應(yīng)激等有關(guān)[3-7]。但AD發(fā)病機(jī)制和中藥復(fù)方的作用機(jī)制都十分復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)與多向藥理學(xué)整合，揭示多分子藥物協(xié)同作用對(duì)于疾病的影響[8-9]，可能有助于尋找大補(bǔ)元煎治療AD的活性成分及效應(yīng)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 大補(bǔ)元煎活性成分及靶點(diǎn)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[10]中(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索人參、山藥、熟地黃、杜仲、當(dāng)歸、山茱萸、枸杞子、甘草的活性成分，并根據(jù)Pubmed、中國(guó)知網(wǎng)已發(fā)表的文獻(xiàn)補(bǔ)充。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)作為依據(jù)，篩選出OB≥30%且DL≥0.18的成分，導(dǎo)入TCMSP平臺(tái)獲取對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)[11](https://www．uniprot．org)，篩選出已驗(yàn)證且物種為“Homo sapiens”的靶點(diǎn)，統(tǒng)一為官方推薦的基因名。

1.2 AD疾病靶點(diǎn)篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[12](https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)[13](http://www.omim.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)[14](http://db.idrblab.net)以“Alzheimer disease”為關(guān)鍵詞，查詢相關(guān)靶點(diǎn)。在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)[15](https://www.drugbank.ca)查詢AD治療藥物的作用靶點(diǎn)予以補(bǔ)充。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)定相關(guān)性評(píng)分(Relevance score)>10篩選靶點(diǎn)。對(duì)以上4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果取并集，得到AD的疾病靶點(diǎn)。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)間的相互作用，將二者取交集得到大補(bǔ)元煎治療AD的潛在作用靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)[16](https://string-db.org/)，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值為0.9，獲得蛋白—蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)關(guān)系，進(jìn)而利用Cytoscape 3.7.1軟件[17]繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO生物功能與KEGG通路富集分析

將大補(bǔ)元煎治療AD的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)[18](http://metascape.org/gp/index.html)，設(shè)置P<0.01，進(jìn)行基因本體 (gene ontology，GO)生物功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，利用ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將數(shù)據(jù)可視化。

1.5 中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用CytoScape 3.7.1軟件構(gòu)建中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖，其中單味中藥、活性成分、基因靶點(diǎn)、信號(hào)通路以節(jié)點(diǎn)(node)表示，各節(jié)點(diǎn)間相互關(guān)系以邊(edge)表示。通過Network Analyzer功能分析網(wǎng)絡(luò)的主要拓?fù)鋮?shù)，包括連接度、緊密中心度及中介中心度，分析發(fā)揮作用的主要成分及高效應(yīng)靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 大補(bǔ)元煎活性成分及靶點(diǎn)

根據(jù)篩選條件，檢索得到大補(bǔ)元煎各中藥的活性成分及靶蛋白，運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。剔除無(wú)對(duì)應(yīng)靶基因的信息，得到潛在活性成分175個(gè)，其中人參17個(gè)、山藥12個(gè)、熟地黃2個(gè)、杜仲25個(gè)、當(dāng)歸2個(gè)、山茱萸14個(gè)、枸杞子36個(gè)、甘草88個(gè)(部分成分同時(shí)存在于多個(gè)中藥)。進(jìn)一步檢索得到各中藥的作用靶點(diǎn)，人參113個(gè)、山藥76個(gè)、熟地黃31個(gè)、杜仲208個(gè)、當(dāng)歸52個(gè)、山茱萸68個(gè)、枸杞子198個(gè)、甘草229個(gè)。將靶點(diǎn)取并集，共得到潛在靶點(diǎn)272個(gè)。

2.2 AD疾病相關(guān)靶點(diǎn)

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得靶點(diǎn)1461個(gè)，從OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得靶點(diǎn)284個(gè)，從TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得靶點(diǎn)140個(gè)，從DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得靶點(diǎn)89個(gè)。將4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果取并集，共得到AD相關(guān)靶點(diǎn)1651個(gè)。

2.3 AD成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將大補(bǔ)元煎成分靶點(diǎn)與AD疾病靶點(diǎn)取交集，得到大補(bǔ)元煎治療AD的潛在靶點(diǎn)187個(gè)，導(dǎo)入STRING平臺(tái)，隱藏16個(gè)游離節(jié)點(diǎn)，得到PPI關(guān)系數(shù)據(jù)。在CytoScape3.7.1軟件中，設(shè)置節(jié)點(diǎn)度(degree)值越大節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，結(jié)合評(píng)分(combined score)越高邊越粗，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共涉及171個(gè)節(jié)點(diǎn)，901條邊，見圖1。其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、淀粉樣-β前體蛋白(APP)、RAC-a絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、細(xì)胞腫瘤抗原p53(TP53)節(jié)點(diǎn)度較大，表明這些基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要意義，可能是大補(bǔ)元煎治療AD的高效應(yīng)靶點(diǎn)，見表1。

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)中高效應(yīng)靶點(diǎn)參數(shù)

2.4 GO生物功能與KEGG通路富集分析

對(duì)大補(bǔ)元煎治療AD的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，將每個(gè)富集結(jié)果的前20條可視化。分子功能分析顯示，這些靶點(diǎn)主要涉及G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、激酶結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、兒茶酚胺結(jié)合等(見圖2A)。細(xì)胞組分分析顯示，靶點(diǎn)主要涉及膜筏、樹突、突觸后膜、受體復(fù)合物、囊泡腔等(見圖2B)。生物過程分析顯示，靶點(diǎn)涉及細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、血液循環(huán)、炎癥反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、活性氧代謝過程等(見圖2C)。KEGG通路分析顯示，大補(bǔ)元煎治療AD的機(jī)制可能與癌癥通路、神經(jīng)活性配體—受體相互作用、cAMP 信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、5-羥色胺能突觸等有關(guān)(見圖2D)。

圖1 大補(bǔ)元煎治療AD潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

注：A分子功能；B細(xì)胞組分；C生物過程；D：KEGG通路。

2.5 中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)藥物與疾病的187個(gè)交集靶點(diǎn)，再次對(duì)活性成分進(jìn)行篩選，得到與靶點(diǎn)有關(guān)的成分156個(gè)。以8味中藥、156個(gè)活性成分、187個(gè)靶點(diǎn)和20條相關(guān)通路為基礎(chǔ)，構(gòu)建中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。節(jié)點(diǎn)的連接度越大則與其他節(jié)點(diǎn)的連接關(guān)系越多，緊密中心度越大則該節(jié)點(diǎn)越接近網(wǎng)絡(luò)中心位置，中介中心度越大則該節(jié)點(diǎn)在維持網(wǎng)絡(luò)緊密連接性中越重要。活性成分中的槲皮素(quercetin)、山奈酶(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、Cinchonan-9-al, 6′-methoxy-，(9R)-、(-)-Tabernemontanine、異鼠李素(isorhamnetin)、刺芒柄花素(formononetin)等連接度、緊密中心度、中介中心度較高，可能是大補(bǔ)元煎治療AD的主要成分(見表2)。靶點(diǎn)中的前列腺素G/H合酶2(prostcglandin G/H synthase and cyclooxygenase,PTGS2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、雄激素受體(androgen receptor,AR)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)、胰蛋白酶-1(PRSS1)、鈉通道蛋白5型亞基α(SCN5A)、鈣調(diào)蛋白-1(calmodulin 1,CALM1)等連接度、緊密中心度、中介中心度較高，可能是大補(bǔ)元煎治療AD的高效應(yīng)靶點(diǎn)(見表3)。

3 討論

AD屬于一種神經(jīng)退行性疾病，病理特征包括神經(jīng)元及神經(jīng)連接的損傷和丟失、纖維纏結(jié)、淀粉樣蛋白斑塊和炎癥[19]。目前，臨床用于治療AD的藥物主要有膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏)和谷氨酸受體拮抗劑(美金剛)，但它們均不能阻止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展。張景岳認(rèn)為呆病病因復(fù)雜，表現(xiàn)“千奇萬(wàn)怪，無(wú)所不至”，治療之機(jī)在于“胃氣元?dú)庵畯?qiáng)弱”，因此扶助元?dú)鈱?duì)于呆病的治療尤為重要，以大補(bǔ)元煎救本培元、補(bǔ)益氣血，因此大補(bǔ)元煎治療AD具備中醫(yī)理論支撐。但是現(xiàn)有研究尚未完全闡明大補(bǔ)元煎治療AD的藥理機(jī)制，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從成分、靶點(diǎn)、途徑等多角度對(duì)大補(bǔ)元煎的有效成分和作用機(jī)制進(jìn)行了分析。

注：三角形代表中藥；圓形代表活性成分；菱形代表靶點(diǎn)；箭頭代表通路。節(jié)點(diǎn)越大代表度值越大。

表2 大補(bǔ)元煎主要活性成分網(wǎng)絡(luò)參數(shù)

表3 大補(bǔ)元煎治療AD高效應(yīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)

本研究共篩選出175個(gè)活性成分，主要發(fā)揮治療作用的成分可能是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇等，這些成分通過抑制Aβ聚集和Tau磷酸化、抑制乙酰膽堿水解、減輕氧化應(yīng)激、抑制炎癥、改善神經(jīng)元可塑性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。槲皮素干擾Aβ寡聚體形成以減輕其神經(jīng)毒性[20]，通過MAPK和PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)Tau過度磷酸化[21]，競(jìng)爭(zhēng)性抑制AChE以抑制乙酰膽堿水解[22]，誘導(dǎo)Nrf-2-ARE和PON2以增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力[23]，以及通過減少NO產(chǎn)生、小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS基因表達(dá)、炎癥因子產(chǎn)生來抑制神經(jīng)炎癥[24-25]。山奈酚上調(diào)谷胱甘肽和SOD活性以對(duì)抗ROS毒性，通過NF-κB、p38MAPK、AKT通路抑制炎癥，促進(jìn)BDNF表達(dá)以改善神經(jīng)元可塑性[26]。β-谷甾醇、豆甾醇均可促進(jìn)APP的非淀粉樣生成，清除自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷[27-30]。

本研究共篩選出187個(gè)潛在靶點(diǎn)，綜合PPI網(wǎng)絡(luò)與中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)，參數(shù)值較高的有APP、STAT3、PTGS2、PTGS1、AR等，可能是大補(bǔ)元煎的高效應(yīng)靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)均被證明在AD腦中發(fā)生變化，與Aβ聚集和炎癥過程相關(guān)。APP是Aβ前體蛋白，Aβ寡聚體和纖維聚集物是AD腦內(nèi)重要的病理改變，Aβ寡聚體具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性，Aβ纖維聚集物可引起氧化損傷和炎癥反應(yīng)[31-33]。STAT3是星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的典型誘導(dǎo)因子，在AD腦中被激活，STAT3基因缺陷可上調(diào)Aβ清除途徑，減輕炎癥因子激活，降低受損突觸負(fù)荷[34]。PTGS2與PTGS1是將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2的同工酶，前列腺素合成增加引起膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子水平增加，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[35]。抑制PTGS1和PTGS2可調(diào)節(jié)去甲腎上腺素和多巴胺水平相關(guān)通路的基因表達(dá)，抵消Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性[36]。AR是雄激素受體，生理濃度的雄激素能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬和清除Aβ42并抑制炎癥反應(yīng)，老年男性較低的雄激素水平是AD的危險(xiǎn)因素，而女性患遲發(fā)性AD的風(fēng)險(xiǎn)是男性的2倍[37-38]。

KEGG通路富集分析顯示，相關(guān)性較高的有癌癥通路、神經(jīng)活性配體—受體相互作用、cAMP 信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、5-羥色胺能突觸等。根據(jù)顯著性和富集的靶點(diǎn)數(shù)量分析，癌癥通路的相關(guān)性最高。流行病學(xué)研究表明，癌癥與AD的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，一些共同的生物學(xué)機(jī)制對(duì)二者產(chǎn)生相反的效應(yīng)，涉及p53、PIN1、Erk、PKC等[39-40]。p53信號(hào)通路也是本研究富集到的通路之一，它被DNA損傷、氧化應(yīng)激、癌基因激活等多種應(yīng)激信號(hào)激活，產(chǎn)生細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老或凋亡的效應(yīng)。Aβ42也可直接結(jié)合并激活p53啟動(dòng)子，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[41]。PIN1、Erk1/2、PKC均可促進(jìn)APP的非淀粉樣切割，PIN1還能抑制Tau過度磷酸化，在AD和輕度認(rèn)知障礙患者中低水平表達(dá)[40,42-43]。

本研究系統(tǒng)闡述了大補(bǔ)元煎治療AD的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機(jī)制，從藥理學(xué)角度科學(xué)地體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀念。在后續(xù)研究中，可以對(duì)篩選出的靶點(diǎn)和通路進(jìn)行驗(yàn)證，從而為經(jīng)典名方大補(bǔ)元煎的臨床應(yīng)用奠定更加堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。