正交像散高密度三維單分子定位顯微的數值模擬*

林丹櫻 武澤凱 于斌 黃黎琳 張瀟 屈軍樂

(深圳大學生物醫學光子學研究中心/物理與光電工程學院,光電子器件與系統重點實驗室,深圳 518060)

單分子定位顯微(single molecule localization microscopy,SMLM)成像技術利用熒光分子的稀疏發光、探測及定位,實現了納米級空間分辨率的超分辨成像.為了提高其時間分辨率,需要提高同時發光的熒光分子密度.但隨著分子密度的提高,不同分子的點擴散函數(point spread function,PSF)在探測器上將發生嚴重的重疊現象,導致空間分辨率降低,尤其是在進行三維SMLM 成像時.為了解決這一問題,本文提出了一種基于正交像散的高密度三維單分子定位超分辨成像方法,并對該方法進行分析和數值模擬研究.該方法的核心是在單分子定位顯微鏡中將采集的熒光分成兩束成像在同一個探測器的兩個區域,并在兩個通道中各引入一個光學參數相同但取向相互正交的柱透鏡,實現對同一個熒光分子正負兩個像散PSF 圖像的同時探測,然后建立該成像過程的線性投影模型,利用壓縮感知算法求解出熒光分子的三維定位信息.結果表明,由于兩個正交柱透鏡產生的一組正交像散PSF 對作為一個分子的系統響應時具有較低的相關性,該方法的高密度三維定位準確性可顯著優于采用單個柱透鏡的傳統像散方法,且離焦程度越大兩個像散PSF 的形狀差異越大,這種準確定位的優勢就越明顯.

1 引言

近十幾年來,以隨機光學重建顯微[1?4]和光激活定位顯微[5]為代表的單分子定位顯微(single molecule localization microscopy,SMLM)成像技術繞過了光學衍射極限對成像分辨率的限制(約為觀察波長的1/2),實現了納米級空間分辨率的超分辨成像,已被應用于生命科學研究并推動了相關領域的發展.SMLM 利用熒光分子的閃爍,將空間上原本相互重疊的分子像斑—即成像系統的點擴散函數(point spread function,PSF)—在時間上進行分離,進而通過對稀疏PSF 的探測和定位來重構超分辨圖像,因此獲得一幅超分辨圖像通常需要采集數萬幀原始圖像,時間分辨率很低.

采用高密度成像方法可顯著提高時間分辨率.所謂高密度成像,是指以更高的熒光分子密度記錄原始圖像,從而減少重構一幅超分辨圖像所需的原始圖像數量.但這樣做同時增加了單幀圖像中PSF 之間的重疊程度,需要借助更復雜的算法來實現單分子定位.例如多點擬合算法采用多個PSF 模型來擬合,從而提高對重疊分子的識別能力和定位精度[6];壓縮感知算法利用分子定位信息滿足稀疏先驗條件和探測過程的非自適應線性投影關系,采用最優化方法來重構信號[7].目前這些方法在高密度二維單分子定位超分辨成像中已經得到了較好的應用.

然而,高密度三維單分子定位超分辨成像至今仍相對困難.這是因為,三維PSF 不僅在軸向上變化緩慢并呈對稱分布,而且體積的擴展使得彼此間更容易發生重疊,導致軸向定位精度低甚至難以定位.目前已有一些方法可以一定程度上實現高密度三維單分子定位成像.例如,2012 年Babcock 等[8]利用單個柱透鏡產生的像散破壞三維PSF 的軸向對稱性,并采用多點擬合算法進行定位;2014 年Gu等[9]通過同時采集三維PSF 的兩個不同焦面,并結合壓縮感知算法進行定位;同年,Min 等[10]則將兩種方法進行結合,進一步提高了軸向定位精度.這幾種方法都較好地實現了高密度三維單分子定位并提高了定位精度,但由于單個分子的三維像散PSF 離焦面較遠時其形狀變化變得緩慢,這使得定位精度僅能在焦面附近保持較高水平.2015年,Huang 等[11]采用三個焦面互相錯開的柱透鏡對同一個PSF 產生不同程度的像散,并結合一種快速無偏離連續空間壓縮感知算法,較好地解決了軸向定位精度一致性的問題.然而,需要同時對三個焦面錯開的三維PSF 進行有效探測使得軸向范圍受到了嚴格的限制,這種三焦面方法的軸向定位范圍要小于傳統像散法.針對高密度三維單分子定位存在的上述問題,本文提出了一種基于正交像散的高密度三維單分子定位超分辨成像方法,并對其進行了詳細的分析和數值模擬研究.

2 成像方法

2.1 成像光路和正交像散原理

圖1(a)為正交像散單分子定位成像方法的光路示意圖.該方法與傳統基于單個柱透鏡的像散三維單分子定位成像方法[3]相比,最主要的不同之處在于顯微鏡采集的熒光信號被均分成傳播方向互相垂直的兩束,分別經兩個探測通道后成像于同一個EMCCD 相機的兩個不同區域.圖1(a)中,可調光闌A 為兩個方向獨立可調的矩形光闌,位于顯微鏡成像透鏡的后焦面,用于調節視場大小.兩個探測通道中各包含有一個長焦距(1000 mm)柱透鏡,兩者型號和參數相同但取向相互正交,用于實現對同一個熒光分子的正負兩種相反的像散.這樣,對于同一個熒光分子,當其處于不同軸向深度z時,將探測到一組正交像散PSF 圖像對(如圖1(b)所示),同時用于三維定位.

與采用單個柱透鏡的傳統像散法[3]類似,正交像散法成像時在采集實際樣品圖像之前需要先利用稀疏分布的熒光珠樣品采集圖像并制作校準曲線,即對不同軸向深度z處的PSF 在x和y兩個方向的寬度進行標定.不同的是,正交像散成像需要4 條校準曲線,對應兩個成像通道的兩個方向,如圖1(c)所示.其中散點數據為利用二維非對稱高斯模型對成像系統(采用100×/NA1.45 油浸物鏡)采集的不同深度熒光珠(直徑100 nm,發射中心波長680 nm)的正交像散PSF 圖像進行擬合獲得的x和y方向的PSF 寬度wx和wy(取2 倍標準差),實線為多項式擬合[3]結果,擬合參數在后續數據處理時用于待測樣品的三維定位.值得指出的是,雖然實際成像系統中兩通道的焦面(即wx=wy處)很難做到完全一致,但與多焦面成像方法不同的是,這種錯開并不是必須的,因此原則上采用這種方法是可以無需犧牲成像深度的.

圖1 正交像散單分子定位成像光路和原理示意圖 (a)成像光路示意圖;(b)正交像散PSF 圖像對;(c)正交像散校準曲線.OL,物鏡;DM,二向色鏡;EF,發射濾光片;BS,分束器;A,光闌;CL,柱透鏡;L,透鏡;M,平面鏡;EMCCD,電子倍增電荷耦合器件Fig.1.Schematic diagram of the optical path and principle of single molecule localization imaging based on orthogonal astigmatism:(a) Optical path;(b) orthogonal astigmatic PSFs;(c) calibration curves.OL,objective lens;DM,dichroic mirror;EF,emission filter;BS,beam splitter;A,aperture;CL,cylindrical lens;L,lens;M,mirror;EMCCD,electron-multiplying charge-coupled device.

2.2 分子定位及圖像重建方法

通過建立上述正交像散成像過程的線性投影模型,可利用壓縮感知算法求解熒光分子的三維定位信息.本文所采用的壓縮感知算法是在TVSTORM算法[12]的基礎上進行改進的.

如前所述,對于樣品中的一個熒光分子,EM CCD 將采集到一組正交像散PSF 圖像對.因此,設樣品中N個熒光分子組成的“源信號”X如(1)式所示,則雙通道圖像μ(μ=[μ1,μ2])為X與兩個PSF 的卷積,可用(2)式表示:

其中θL=(θx,θy,θz)和θI分別為第i個分子的三維坐標和強度;Θ為所有N個熒光分子的這4 個參數的組合;θb為背景噪聲;k=1,2 分別對應通道I 和通道II;(u,v)為各通道圖像的像素坐標;Φk為對應通道k的觀測矩陣,代表位于θL的熒光分子對通道k圖像的貢獻,可根據正交像散校準曲線構造.因此,單分子定位的任務,就是利用上述模型從實際探測到的雙通道圖像y(y=[y1,y2])中求解出Θ.考慮到EMCCD 對較弱的單分子熒光的探測滿足泊松分布,TVSTORM 算法采用泊松噪聲模型來構建損失函數[12].這里,針對正交像散成像,將泊松損失函數L(y|X)定義為

其中,P代表概率,yk和μk分別為通道k的實際圖像和根據(2)式計算得到的“理想”圖像,0<β ?1,用于提高對數項的穩定性.

通過最小化該損失函數,可求解(逼近)源信號X的參數Θ,重構出超分辨圖像.TVSTORM算法的迭代過程主要包含兩層[12]:第一層是從圖像中尋找到一個新的熒光分子并初步確定其位置及強度,第二層是進一步優化該分子的定位和強度.針對正交像散法得到的雙通道圖像.第一層迭代的具體做法是在第n+1 次迭代中,利用第n次迭代得到的已有熒光分子信息(記為Θ(n))和觀測矩陣Φ(Φ=[Φ1,Φ2])生成雙通道理想圖像μ,然后通過最小化泊松損失函數的一階泰勒近似(如(4)式所示,其中S為雙通道圖像的圖像尺寸),從其中一個通道(k(n+1))的圖像中定位到一個新的熒光分子,獲得其位置信息,并通過最小二乘準則估計其強度(如(5)式所示),從而得到第n+1 次迭代的結果Θ(n+1),由第二層的迭代進行進一步優化.

第二層采用迭代梯度下降方法,通過最小化(3)式的雙通道圖像泊松損失函數獲得Θ(n+1)的極大似然估計來進一步優化定位結果.其中,下降方向通過分別計算損失函數在x,y,z和I這4 個方向的偏導數來確定,下降步長采用回溯線搜索方法來確定,以加快迭代收斂速度.精煉后的熒光分子信息Θ(n+1)返回第一層并進入下一次迭代,當新增熒光分子的強度低于預設閾值時迭代終止.

3 結果與討論

3.1 PSF 相關性分析

柱透鏡像散法能夠實現單分子三維定位的基本原理,是基于不同軸向深度的熒光分子的二維PSF 呈現為不同取向和不同橢圓度的橢圓.因此,兩個不同熒光分子的PSF 區別越明顯,就越容易被準確定位和分辨.可通過計算兩個PSF 之間的相關系數來半定量地表征兩個分子能夠被準確定位的概率[10].

圖2 以偽彩圖的形式直觀地展示了位于(0,0,z1)和(dx,dy,z2)的兩個熒光分子PSF 的相關系數,偽彩色從藍到紅對應相關系數從0 到1.圖2(a)對應傳統采用單個柱透鏡的像散成像,圖2(b)對應正交像散成像.值得注意的是,對于正交像散,每個熒光分子的PSF 實際上是一組正交像散PSF圖像對(如圖1(b)).圖2 中第1—3 列為兩個熒光分子位于同一深度(z1=z2=–550,0 和550 nm)但橫向錯開不同距離時的情況,第4 列為兩個熒光分子橫向位置相同(即dx=dy=0)但分別位于不同深度(z1,z2)時的結果.

圖2 PSF 相關系數 (a)傳統像散法;(b)正交像散法Fig.2.Mutual correlation values between PSFs:(a) Traditional astigmatic method;(b) orthogonal astigmatic method.

可以看出,當離焦較遠時,兩種成像模式得到的PSF 相關性有很大差異.采用傳統像散法時,在焦面以下550 nm 處,x方向錯開了將近2 μm 的兩個PSF 相似程度依然較高,難以準確定位;反之,在焦面以上550 nm 處的兩個PSF 則是在y方向相似程度較高不易定位.這與之前文獻中關于像散法在兩個方向上分辨能力不同的報道[13]是符合的,是由加入柱透鏡后兩個方向的實際焦面位置不同導致的.但當采用正交像散成像方法時,這種情況得到了很大程度的改善,即不管是在焦面以上還是以下,PSF 的相關性在x和y兩個方向變得更加對稱,且總體要明顯低于傳統像散法,說明采用這種方法在離焦較遠時仍能得到相似程度較低的PSF 對,從而為準確定位距離較近的熒光分子提供了條件,提高了系統的高密度定位能力.

3.2 數值模擬實驗

為定量評估該正交像散成像方法的性能,基于圖1(c)中的校準曲線進行數值模擬實驗研究.在模擬實驗中,利用校準曲線產生一系列三維位置隨機的PSF 來模擬實驗中采集的原始圖像.圖3(a)所示為模擬實驗產生的正交像散成像的單幀雙通道閃爍圖像,圖像大小32×32 像素/通道,像素尺寸160 nm×160 nm,熒光分子密度1/μm2,單個PSF 的探測光子數為500/通道,并添加泊松噪聲.圖中黑色小叉表示隨機生成的“分子”的橫向位置,其軸向深度則體現在PSF 的形狀上.作為對比的傳統像散法模擬時采用通道I 的閃爍圖像,但光子數設置為1000.

圖3 單幀雙通道圖像及定位結果 (a)單幀雙通道圖像;(b)正交像散法定位結果;(c)傳統像散法定位結果Fig.3.Single frame image and localization results:(a) Single frame of two-channel image;(b) localization results using orthogonal astigmatic method;(c) localization results using traditional astigmatic method.

3.2.1 三維定位結果的直觀比較

利用前述算法對該單幀閃爍圖像中的PSF 對進行定位,結果如圖3(b)所示,其中兩個圖像分別顯示了定位結果與兩個通道的原始圖像之間的對比.作為對照,圖3(c)給出了采用傳統像散成像的定位結果.圖中黑色小叉仍代表模擬圖像中“分子”的真實橫向位置,白色小橢圓中心代表橫向定位結果,其與黑色小叉重合的程度直觀表示橫向定位的準確性;虛線黑色橢圓和實線白色橢圓分別代表根據已知的軸向深度和軸向定位結果得到的PSF 形狀(依據校準曲線),兩者的相似程度直觀表示軸向定位的準確性.對比圖3 結果可以看出,采用正交像散法可顯著提高三維定位的準確性,尤其是在PSF 重疊程度較大(即局部密度較高,如圖3(c)中黑色箭頭所指區域),或PSF 橢圓度較高的情況下(即離焦較遠,如圖3(c)中白色箭頭所指),準確定位的優勢更加明顯,說明該方法適用于處理高密度數據,且對于離焦較遠的分子會有更好的定位效果,與前面的分析是一致的.

3.2.2 不同軸向深度定位結果的統計分析

為了定量分析定位性能,可產生若干幀模擬閃爍圖像并重復上述定位過程,計算各“分子”的定位坐標與真實坐標之間的均方根誤差(root mean squared error,RMSE),以定量描述定位的準確性.計算公式如下:

其中,j=x,y,z,N表示定位得到的分子總數;(θxi,θyi,θzi)表示第i個分子的定位坐標;(θxi0,θyi0,θzi0)表示其真實坐標.

圖4 給出了位于不同軸向深度的“分子”沿各方向定位的RMSE 值,并與傳統像散法定位結果進行對比.模擬實驗中同一幀閃爍圖像不同“分子”的橫向位置設置為隨機,但軸向深度設置為相同(如200 nm),熒光分子密度固定為1/μm2,每個深度處累計定位1000 幀.從圖4 可以明顯看出,采用正交像散法相比傳統像散法,離焦“分子”在3 個方向的定位準確性均有顯著提高,尤其是焦面以下x方向定位準確性和焦面以上y方向定位準確性的提高,與前面的PSF 相關性分析是完全符合的,進一步驗證了該方法對于離焦較遠的分子會有更好的定位效果的結論.除了RMSE,圖4 還給出了定位召回率和錯誤率的比較,同樣可以看出正交像散法要明顯優于傳統像散法.

圖4 不同軸向深度分子定位準確性、召回率和錯誤率比較Fig.4.Comparison of localization accuracy,recall rate and error rate of molecules with different axial depths.

3.2.3 不同熒光分子密度定位結果的統計分析

此外,為了更好地表征正交像散法對于高密度數據的定位性能,圖5 給出了不同分子密度下的各方向定位的RMSE 值及定位召回率和錯誤率的比較.其中,模擬實驗中不同“分子”的三維位置均設置為隨機,每個分子密度下累計定位1000 幀.從圖5 可以明顯看出,與傳統像散法相比,正交像散法在分子密度越高時優勢越明顯,說明該方法適用于高密度數據的處理.

圖5 不同密度分子的定位準確性、召回率和錯誤率比較Fig.5.Comparison of localization accuracy,recall rate and error rate of molecules with different densities.

3.2.4 模擬樣品的超分辨圖像

為了更直觀地展示正交像散法的超分辨成像效果,以一些特定結構作為模擬樣品,按照前述相同方法產生正交像散閃爍圖像進行定位和超分辨重構.圖6 給出了螺旋線的三維定位超分辨圖像.其中,圖6(a)和圖6(b)分別為正交像散和傳統像散兩種方法得到的結果.螺旋線半徑為1200 nm,相鄰層軸向距離為400 nm.從圖6 可以直觀地看出,采用傳統像散法在遠離焦面時,在螺旋線以外存在很多不準確的定位點,而采用正交像散法則能在整個軸向探測范圍內更加準確地還原出螺旋線的結構.

圖6 螺旋線的模擬成像結果 (a)正交像散法;(b)傳統像散法Fig.6.Simulated imaging results of a helix structure:(a) Orthogonal astigmatic method;(b) traditional astigmatic method.

圖7 所示的是6 組平行線的模擬超分辨成像結果.其中,x方向和y方向平行線的間距從小到大分別為50,100 和150 nm,平行線的軸向深度連續變化,如圖中偽彩色所示.圖7(a)和圖7(b)分別對應正交像散和傳統像散兩種方法.從圖7 可以看出,兩種方法都能夠清晰地分辨出間距150 nm的平行線,但隨著間距越來越小,在軸向深度離焦較遠時,傳統像散法的圖像開始變得模糊,而正交像散法則依然可以清楚地分辨出兩條平行線.圖7(c)—圖7(f)是距離50 nm 的兩組平行線的放大圖.可以直觀地看出,采用傳統像散法在軸向深度約大于400 nm 時,y方向的分辨能力開始變得很差,因此x方向的平行線變得幾乎無法分辨(圖7(d)綠色方框所示),而焦面另一側的情況則剛好相反(圖7(f)黃色方框所示).但是采用正交像散法時,x和y兩個方向上均能清楚地分辨出兩條平行線(圖7(c)和圖7(e)中對應的方框所示).對方框區域內的定位結果進行y方向或x方向(即垂直于直線方向)的雙峰擬合,可得到正交像散成像時兩組平行線雙峰間距分別為46 和48 nm,與模擬時設置的真實值50 nm 很接近,可見正交像散法在離焦較遠的情況下仍能準確得到三維定位信息.

圖7 平行線的模擬成像結果 (a),(c),(e)正交像散法;(b),(d),(f)傳統像散法;(c)—(f)間距最小(50 nm)平行線的放大圖;(g)圖(c)和(d)的綠色方框區域的強度分布曲線;(h)圖(e)和(f)的黃色方框區域的強度分布曲線.標尺大小:(a),(b) 500 nm;(c)—(f) 200 nmFig.7.Simulated imaging results of parallel line structures:(a),(c),(e) Orthogonal astigmatic method;(b),(d),(f) traditional astigmatic method;(c)–(f) zoomed-in view of the minimum spacing (50 nm) lines;(g) cross-sectional profiles of the green boxes in panel (c) and (d);(h) cross-sectional profiles of the yellow boxes in panel (e) and (f).Scale bars:(a),(b) 500 nm;(c)–(f) 200 nm.

3.2.5 雙通道圖像偏差的影響分析

在實際的成像實驗中,盡管在光路調節上可以盡量保證兩個成像通道的一致性,但兩個通道采集到的圖像之間仍不可避免地會存在偏差,包括橫向偏移、旋轉和縮放等,從而影響正交像散成像三維定位的準確性.圖8 給出了雙通道圖像偏差對正交像散法橫向和軸向定位RMSE 值的影響分析,以及經過圖像配準之后的定位重構結果.其中圖8(a)分別為通道II 圖像相比通道I 圖像存在不同橫向偏移量Δx、旋轉角度α和縮放倍數Γ時xy方向和z方向定位的RMSE 值.熒光分子密度固定為1/μm2,軸向深度在–600—600 nm 之間變化.可見,雙通道圖像之間的這幾種偏差,都會導致定位精度不同程度的降低.因此,兩個成像通道采集的圖像需要先進行配準,以盡量消除兩通道圖像之間的不匹配導致的定位精度下降.這里采用常用的傅里葉-梅林變換法對雙通道圖像進行配準[10,11],并對配準效果進行模擬分析.圖8(b)為一組存在雙通道圖像偏差并經過配準后的正交像散成像模擬結果,其中雙通道原始圖像偏差設為Δx=320 nm,α=2°,Γ=0.95.利用雙通道熒光珠圖像進行配準,得到配準參數分別為Δx'=–352 nm 和Δy'=–41 nm,α'=–1.9125°,Γ'=1/0.9505.作為對比,圖8(c)給出了雙通道圖像不存在任何偏差時的模擬成像結果.可以看出,存在雙通道偏差的圖像數據配準后仍能很好地重構出超分辨結構,但由于圖像配準后仍有一定誤差(如橫向偏移配準精度約為30—40 nm),因此與理想無偏差情況相比,定位效果略有下降.從圖8(a)的定量結果還可以看出,配準誤差導致的RMSE 值的改變幅度已經很小,而采用具有更高配準精度的方法還可以進一步減少雙通道圖像偏差對定位的影響.

圖8 雙通道圖像偏差的影響和有無圖像偏差及配準的模擬成像結果比較 (a)定位準確性隨橫向偏移量、旋轉角度和縮放倍率的變化;(b)有偏差雙通道圖像配準后的模擬成像結果;(c)無偏差雙通道圖像的模擬成像結果.標尺大小:500 nmFig.8.Influence of deviation between two channel images,and comparison of simulated imaging results with and without image deviation and registration:(a) Localization accuracy versus lateral offset,rotation angle and scaling ratio;(b) simulated image obtained after registration of biased dual channel images;(c) simulated image of unbiased dual channel images.Scale bars:500 nm.

4 總結與展望

針對高密度三維單分子定位中PSF 重疊導致的定位能力下降的問題,發展了一種基于正交像散的高密度三維單分子定位超分辨成像方法.詳細闡述了該正交像散單分子定位成像方法的原理和實現過程,并對該成像方法進行了分析和數值模擬研究.結果表明,利用該方法可以在無需犧牲成像深度的前提下顯著提高離焦熒光分子的三維定位精度.其根本原因在于,采用正交像散法時一個熒光分子對應一組正交像散PSF 圖像對,離焦情況下這一組自身形狀差異很大的PSF 對作為一個整體,與另一個分子的PSF 對之間具有比單獨的PSF圖像更低的相關性.換句話說,采用兩個取向相互正交的柱透鏡,可以一定程度上抵消x和y方向的兩個焦面分別位于成像焦面兩側對單分子定位的影響,從而提高高密度三維定位能力.

在實際的成像實驗中,兩個成像通道之間總是不可避免地會存在偏差,因此除了在光路上盡量保證兩個成像通道的一致性之外,對于兩個通道采集到的圖像通常需要先進行配準,以盡量消除兩通道圖像的不匹配導致的定位精度下降.在此基礎上,考慮兩個成像通道之間引入的不同像差,以及因成像在探測器的不同區域而導致的微小差別,分區域進行配準,將有利于進一步提升雙通道圖像之間的配準精度,從而消除實際實驗中存在的雙通道圖像偏差對定位精度的影響.