大口黑鱸免疫球蛋白單克隆抗體的制備及初步應用

張成賽，尹文林，李 明，曹 錚，藺凌云，潘曉藝，沈錦玉，王春鳳，姚嘉赟,，楊桂連

(1.吉林農業大學 動物科學與技術學院，吉林省動物微生態制劑工程研究中心，吉林 長春 130118；2.浙江省淡水水產研究所，農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江省魚類健康與營養重點實驗室，浙江 湖州 313001； 3.金華市水產技術推廣站，浙江 金華，321051)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)又稱加州鱸，是我國重要的經濟養殖品種，其肉質肥美，營養價值高，肌間刺相對較少，深受人們的喜愛，因此在我國南北地區均有養殖，2019年全國養殖產量為4.778×105t，經濟效益很好[1-5]。但隨著養殖規模的不斷擴大，養殖密度的不斷提高，以及養殖環境的不斷惡化，近年來大口黑鱸養殖過程中不斷暴發各種疾病，而在養殖階段主要病害是大口黑鱸的“爛身病”，其病原為虹彩病毒科蛙病毒屬(Ranavirus)的大口黑鱸虹彩病毒(Largemouthbassranavirus，LMBV)[6-9]，據調查該病的發病率可達80%以上，最高死亡率可達60%以上，給養殖戶造成了巨大的經濟損失，是制約該品種養殖產業發展的一大瓶頸[10-12]。但目前對該病沒有有效的治療藥物。藥物治療會帶來藥物殘留、環境污染、耐以及食品安全等問題，而免疫防治是一項切實可行的方案。但目前國內外對大口黑鱸免疫學的基礎研究相對較少，而關于鱸魚免疫球蛋白的研究則更少。張福淼等[13-14]分離純化了花鱸(Lateolabraxmaculatus)血清免疫球蛋白并對其特性進行了分析，劉悅等[15]克隆表達了花鱸免疫球蛋白的重鏈基因，馮娟等[16]對尖吻鱸(Latescalcarifer)的血清免疫球蛋白進行了分離純化和特性分析。目前尚未見大口黑鱸免疫球蛋白單克隆抗體研究方面的報道，而其是評價抗體效價的一個重要指標，因此筆者利用親和層析等方法制備大口黑鱸血清免疫球蛋白，通過雜交瘤篩選技術制備其單克隆抗體，并利用此單克隆抗體建立檢測大口黑鱸血清抗體的酶聯免疫吸附方法，為大口黑鱸病害的早期診斷監測和免疫應答水平的測定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

大口黑鱸購自浙江省湖州市南潯某養殖場，對其進行大口黑鱸虹彩病毒、彈狀病毒以及諾卡氏菌(Nocardia)檢測，結果均為陰性；6—8周齡雌性BALB/c小鼠購自浙江省醫學科學院；小鼠的骨髓瘤細胞SP2/0由本實驗室傳代保存。

1.2 主要試劑

RPMI1640培養液、胎牛血清購自GIBCO公司；8-氮鳥嘌呤、HT培養基、HAT培養基、聚乙二醇、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠免疫球蛋白G購自武漢三鷹生物技術有限公司；Protein A HP柱購自GE公司；其他生化試劑均為國產分析純試劑。

1.3 免疫球蛋白的分離純化

取體質量(485.6±13.2) g大口黑鱸尾靜脈采血，37 ℃放置1 h后，4 ℃放置過夜，離心，取上清液。參考文獻[17]的方法，用硫酸銨沉淀法和親和層析法分離純化免疫球蛋白，并經透析后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，所得免疫球蛋白置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.4 單克隆抗體的制備

取制備的純化免疫球蛋白50 μg，與等體積的弗氏完全佐劑混勻乳化后對BALB/c小鼠進行皮下多點注射免疫，首免后14 d和28 d取純化的免疫球蛋白，與弗氏不完全佐劑混合乳化后繼續免疫2次，并于融合前3 d加強免疫1次。于融合前兩周復蘇小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中傳代培養。培養過程中，在培養液中加入8-氮鳥嘌吟，連續處理3次，使小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0對HAT培養液更加敏感。融合前1 d傳代1次，使融合當天的骨髓瘤細胞處于對數生長期。參考文獻[18]的方法，取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，取融合細胞培養上清液進行酶聯免疫吸附檢測，篩選時以純化的大口黑鱸免疫球蛋白作為包被抗原，將經3次測定均為陽性的細胞孔利用有限稀釋法進行亞克隆，待克隆化至陽性率為100%定株保存。將定株的雜交瘤細胞腹腔接種于BALB/c小鼠，14 d后采集腹水，離心收集上清液即為制備的腹水。

1.5 腹水效價的測定

參考文獻[19]利用酶聯免疫吸附法測定免疫球蛋白的腹水抗體效價。簡而言之，以純化的大口黑鱸免疫球蛋白進行包被，包被質量濃度為2 μg/mL，4 ℃包被過夜后，用2%牛血清白蛋白—磷酸鹽吐溫緩沖液在37 ℃恒溫封閉1 h，再用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次后(每次5 min)，加入采集的經抗體稀釋液梯度稀釋的腹水抗體，同上封閉、洗滌3次后每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標記羊抗鼠免疫球蛋白G(1∶2×104)，再進行封閉洗滌操作后，每孔加入底物顯色液50 μL，37 ℃避光15 min后加入終止液，37 ℃ 15 min后，測定各稀釋組的450 nm光密度[D(450 nm)]，以P/N比值≥2.1時單克隆抗體的最大稀釋度即為其抗體效價。測定過程中以陰性小鼠血清作為陰性對照，以抗體稀釋液作為空白對照，以融合小鼠血清作為陽性對照。

1.6 單克隆抗體的特性研究

單克隆抗體的亞級分類按照單克隆抗體亞型分析試劑盒的使用說明書進行：將雜交瘤培養上清液做100倍稀釋，取150 μL加入反應管，室溫30 s后振蕩使乳膠顆粒重懸，將測試條帶黑色端向下插入反應管，待陽性對照條帶顯現即可讀取結果。靈敏度的測定以2 μg/mL的免疫球蛋白為起始質量濃度進行倍比稀釋，之后按照1.5的方法進行測定，以其能測定抗體的最低包被質量濃度為靈敏度。抗體的特異性測定參考文獻[17]的酶聯免疫吸附法。收集大口黑鱸、鯽(Carassiusauratus)、花鱸、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)等血清為測定抗原，將待測魚血清1000倍稀釋后包被于酶標板，一抗為1000倍稀釋的單克隆抗體腹水，其余步驟同1.5，進行抗體特異性檢測。

1.7 蛋白免疫印跡分析

取純化后的免疫球蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳采用不連續緩沖液垂直電泳系統，濃縮膠為50 g/L,分離膠為120 g/L。電泳及蛋白免疫印跡參考《蛋白質技術手冊》[18]進行。一抗為1∶1000稀釋的抗體腹水，二抗為1∶2000的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠抗體。

1.8 免疫大口黑鱸虹彩病毒抗體效價的測定

隨機選取120尾體質量為(20.5±2.8) g的大口黑鱸(經隨機檢測，不攜帶大口黑鱸虹彩病毒)進行分組，每組30尾，共分為3組。大口黑鱸虹彩病毒滅活疫苗設置高含量組和低含量組，用Reed-Muench法計算，高含量組病毒含量≥2.6×108/mL半數組織培養感染劑量(TCID50)，低含量組病毒含量≥2.6×107/mL半數組織培養感染劑量，待接有大口黑鱸虹彩病毒的細胞病變達到約90%時收獲病毒，-80 ℃反復凍融3次，離心取上清液用0.2%甲醛37 ℃滅活72 h，免疫佐劑為20%鋁膠佐劑，對照組為含相同劑量的甲醛和鋁膠佐劑的1640培養基(含2%胎牛血清、1%雙抗)，每尾試驗魚腹腔注射0.2 mL。在免疫后7、14、21、28、35、42、49、56、63、70 d和84 d于每組試驗組隨機抽取3尾魚，采集血清，測定其中的抗體效價。

2 結 果

2.1 大口黑鱸免疫球蛋白的分離純化

利用親和層析和硫酸銨沉淀法制備大口黑鱸血清免疫球蛋白，經測定其質量濃度為1.2 mg/mL。經SDS-PAGE鑒定后可知，大口黑鱸血清免疫球蛋白的重鏈大小為72 ku(圖1)。蛋白免疫印跡結果顯示，A9E7和C9B9兩株單克隆抗體均能特異性地識別大口黑鱸血清的免疫球蛋白M。

2.2 單克隆抗體效價及特性

經過3次亞克隆最終獲得2株分泌穩定的陽性雜交瘤細胞，分別標記為A9E7和C9B9，將二者分別制備腹水，經酶聯免疫吸附法檢測后確定二者的抗體效價分別為2.187×106和7.29×105(表1)。抗體分型結果表明，A9E7和C9B9均為IgG2a。

抗體A9E7和C9B9的檢測靈敏度分別為10 ng和20 ng。抗體特異性結果表明，A9E7和C9B9均與大口黑鱸血清發生反應，僅A9E7能與花鱸血清能發生交叉反應，僅C9B9能與鱖(Sinipercachuatsi)血清能發生較弱的交叉反應，而黃顙魚、翹嘴鲌(Culteralburnus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鯽、團頭魴(Megalobramaamblycephala)、光唇魚(Acrossocheilusfasciatus)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、黃鱔(Monopterusalbus)、鰱和鳙(Aristichthysnobilis)的血清均不能與2株單克隆抗體發生交叉反應(表2)。

圖1 大口黑鱸血清免疫球蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白免疫印跡Fig.1 SDS-PAGE and Western Blot of serum immunoglobulin from largemouth bass M. salmoidesM.蛋白標準分子質量； A、B.免疫球蛋白M； C、D.分別為A9E7和C9B9與免疫球蛋白M的蛋白免疫印跡結果.M.standard molecular mass of protein; A and B.IgM; C and D.Western Blotting results of A9E7 and C9B9 with IgM, respectively.

表1 單克隆抗體雜交瘤細胞腹水效價

表2 單克隆抗體的特異性

2.3 免疫大口黑鱸虹彩病毒后大口黑鱸抗體水平

大口黑鱸經一次免疫甲醛滅活大口黑鱸虹彩病毒后其體內免疫球蛋白的抗體水平變化結果見圖2。經免疫后，大口黑鱸血清中抗體水平呈先增后降最后趨于穩定的趨勢，且高含量組和低含量組在14 d后均顯著高于對照組(P<0.05)，而高含量組在第28、35、42、49天時均顯著高于低含量組，兩組的峰值均出現在免疫后第35天。經酶聯免疫吸附法檢測確定其抗體效價為1∶1280。

圖2 免疫后大口黑鱸血清抗體水平Fig.2 The serum antibody levels in largemouth bass M. salmoides immunized with LMBV

3 討 論

魚類病毒性疾病具有潛伏期長、發病快、致死率高等特點，通常難以防治，一旦發生可對魚類養殖基地造成毀滅性打擊，嚴重限制了魚類養殖業的發展[20]。目前，在大口黑鱸養殖中，大口黑鱸虹彩病毒是危害最大的病毒之一。為有效防治大口黑鱸虹彩病毒病，借助疫苗進行免疫預防是切實可行的途徑，但疫苗免疫防治效果受諸多因素影響，要達到理想的免疫效果，需考慮大口黑鱸自身免疫系統組成特點及免疫應答規律，而單克隆抗體正是理想的手段之一。單克隆抗體是由B細胞分化增殖的漿細胞產生的針對單一抗原決定簇的抗體，其在魚類免疫學研究中的作用十分關鍵，Han等[21]對抗免疫球蛋白M單克隆抗體的研究表明，許氏平鲉(Sebastesschlegelii)在應對特定病原體時候，機體防御水平與免疫球蛋白M表達水平是正相關的。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有較強優越性，如特異性高、純度高、均質性好、重復性強、成本低、量產可實現性強等，同時單克隆抗體也是評價疫苗效價的重要指標[22]。

3.1 大口黑鱸免疫球蛋白單克隆抗體的生物學特性

筆者制備了2株具有較高靈敏度和特異性的大口黑鱸血清免疫球蛋白的單克隆細胞株。單克隆抗體的交叉試驗結果表明，A9E7和C9B9均能與大口黑鱸血清發生強烈反應，A9E7能與花鱸血清發生交叉反應，C9B9能與鱖血清發生較弱的交叉反應。這兩種魚同屬鱸形目，但為不同科屬魚類，表明鱸形目不同科屬之間的免疫球蛋白具有一定的保守性序列，其血清免疫球蛋白結構具有一定的相似性故而發生交叉反應，但兩株單克隆抗體未與花鱸和鱖全部發生交叉反應，表明不同屬之間的免疫球蛋白也存在一定的差異性。試驗結果還表明，A9E7和C9B9這2株單克隆抗體針對的是大口黑鱸免疫球蛋白的不同抗原位點，A9E7可特異性針對花鱸屬，而C9B9則可特異性針對鱖屬，從遺傳進化角度而言，A9E7對應的抗原表位基因較C9B9更為保守[17]。同時，鲿科的黃顙魚，鯉科的翹嘴鲌、草魚、鯽、團頭魴，合鰓魚科的黃鱔，鰍科的泥鰍等血清均不能與本試驗中的2株單克隆抗體發生交叉反應，表明鱸形目魚類與上述魚類的血清免疫球蛋白相似度較低，其親緣關系較遠。上述結果表明，不同魚類的免疫球蛋白的抗原位點具有較好的特異性和保守性，同時其在某些區域也存在相近的抗原表位決定簇，相近的抗原表位主要存在于親緣關系較近的品種之間[17]。

3.2 大口黑鱸免疫球蛋白單克隆抗體的初步應用

魚類免疫球蛋白是體液免疫的重要組成部分，在魚類免疫中起重要作用，了解魚類免疫應答規律和免疫保護機制可為魚類疫苗免疫效果評價、水產動物免疫診斷等提供技術支撐。目前，國內外對魚類疫苗的免疫效果主要采用免疫保護率以及抗體效價等指標進行評價，同時因魚種類繁多，且不同種屬魚類之間具有不同的免疫球蛋白，其交叉性差[18]，因此不同的魚類需要采用不同的特異性免疫球蛋白抗體進行評價，而目前大口黑鱸還沒有商品化的抗體產品，因此也迫切需要制備特異性強、靈敏度高的抗體用于魚類疫苗免疫效果評估及抗體水平檢測等。筆者利用親和層析法獲得了大小為72 ku的大口黑鱸血清免疫球蛋白的重鏈，并利用雜交瘤技術篩選獲得了2株單克隆抗體，建立間接酶聯免疫吸附法測定其對大口黑鱸免疫球蛋白的檢測靈敏度，可達10 ng和20 ng。張福淼等[13]利用凝膠過濾等方法獲得了花鱸免疫球蛋白的重鏈和輕鏈，其大小分別為72 ku和28 ku 。許娜娜等[14]利用親和層析等方法從花鱸血清中分離獲得了大小分別為79 ku和29 ku的免疫球蛋白，其抗體效價最高可達1.39×105/mg，且蛋白免疫印跡結果也表明其只能識別免疫球蛋白重鏈[23]。這與歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[24]和鱖[25]中血清免疫球蛋白單克隆抗體大部分特異性識別重鏈等研究結果一致，這主要是與魚類免疫球蛋白的輕鏈分子量較小，其免疫原性較弱有關。

本試驗中，通過注射免疫大口黑鱸虹彩病毒，利用建立的間接酶聯免疫吸附法檢測了病毒免疫后大口黑鱸血清抗體應答規律和抗體水平，表明通過本方法獲得的單克隆抗體可以用于滿足鱸魚病害的流行病的血清學和免疫學檢測。

4 結 論

筆者利用飽和硫酸銨鹽析法和親和柱層析法純化大口黑鱸血清的免疫球蛋白，并制備了免疫球蛋白單克隆抗體，其靈敏度和抗體效價分別可達10 ng和2.187×106，可用于大口黑鱸病害早期檢測及免疫應答規律和抗體水平檢測。