油樟內生真菌有效分離和培養關鍵技術

胡連清，周萬海，馮瑞章，陳雨薇，劉雯雯，龔云飛，張繼紅

（1.宜賓學院農林與食品工程學部，四川宜賓 644000；2.四川省油樟工程技術研究中心，四川宜賓 644000；3.簡陽市農業技術推廣中心，四川簡陽 641400）

油樟(Cinnamomum longepaniculatum(Gam-ble)N.Chao 是中國特有的樟科樟屬常綠喬木，其根、莖和葉含有桉葉油素、芳樟醇、樟腦等芳香油，可以制作香料、食品添加劑、醫藥等，具有重要經濟價值[1-3]，是我國重要的經濟樹種. 已有研究表明，油樟精油的主要成分具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[4-5]，油樟本身的植物病害也少，這些特性都可能與油樟的內生真菌有關.

植物內生真菌（endophytic fungi）指生活史中的某一個階段或整個階段寄生在宿主植物的組織內或細胞間隙中，而不會導致宿主病害癥狀的真菌[6-7].幾乎所有的存活植物體內都有內生真菌的存在，植物和內生真菌能夠合成多種具有重要價值的代謝產物，這些產物具有抗腫瘤活性、抗菌活性、抗重金屬脅迫、抗氧化活性等多種抵御生物（病原體損傷）與非生物（干旱、高溫、高鹽）類脅迫的功能，能幫助植物抵御不良環境的脅迫[8]. 植物內生真菌能產生許多代謝物且具有與其宿主植物產生的代謝產物相似的功能，因而可作為新的資源來替代短缺的植物并保護瀕臨滅絕的天然植物物種，具有重要研究意義[9].

從植物組織中分離得到內生真菌，是研究其功能以及多樣性的基礎，關于內生真菌的研究都涉及從植物中分離內生真菌. 在分離植物內生真菌過程中，植物樣本表面的消毒方法和培養基條件是影響分離效果的最關鍵因素之一. 表面消毒方法以及內生真菌分離培養時培養基選擇不當都可能影響內生真菌的生長菌落數量以及真菌種類. 目前關于對油樟內生真菌有效分離和培養關鍵技術的研究幾乎未見相關報道，因此，本研究以春、夏、秋、冬油樟四個季節的根、莖、葉為材料，設置不同的消毒條件和培養基類型，探究適宜油樟組織的表面消毒方法以及內生真菌的分離方法和培養基條件，為獲得更多種類的油樟內生真菌菌株提供保障，也為后續的油樟內生真菌功能性及多樣性等研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

油樟根、莖、葉樣品采集時間分別為2018 年6月、2018 年9 月、2018 年12 月和2019 年3 月，采樣地點為四川省宜賓市高縣月江森林經營所油樟母本園（北緯28°47′77″，東經104°59′76″）；采樣時根據隨機取樣原則選取成年健康植株5 株，取樣的株距在（30～50）m，采集的根莖葉分類混合均勻裝入無菌封口塑料袋，于24 h 內帶回實驗室啟動內生真菌的分離培養. 采集到的夏季樣品用于進行消毒劑種類、消毒時間、消毒程序的確定以及培養基的篩選，采集的秋、冬、春的樣品采用篩選到的分離方法進行內生真菌分離、并進行分屬鑒定，檢驗優化后分離方法的效果.

培養基分別為：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、麥芽浸粉瓊脂培養基（MEA）、察氏培養基（Czapek-Dox Agar）、馬丁培養基（Martin Medium）、卵磷脂吐溫-80 營養瓊脂培養基（TTC Lecithin Tween 80 Nutrient Agar）、玉米粉瓊脂培養基（CMA），油樟浸提液+PDA與胡蘿卜汁+PDA.

1.2 試驗方法

（1）樣品制備

①油樟浸提液：取油樟的根、莖、葉分別10 g，加入100 mL 純凈水，煮沸10 min，濾渣后倒入三角瓶中保存備用.

②胡蘿卜汁：取胡蘿卜30 g，加入100 mL 純凈水，煮沸10 min，濾渣后倒入三角瓶中保存備用.

（2）油樟組織表面消毒方法設計

油樟根、莖、葉各樣品先用自來水流水沖洗（1～2）h，無菌水沖洗3 次. 分別用75%酒精、95%酒精、3%次氯酸鈉、5%次氯酸鈉、75%酒精+3%次氯酸鈉、75%酒精+5%次氯酸鈉、95%酒精+3%次氯酸鈉、95%酒精+5%次氯酸鈉進行消毒，并且每個試驗組設置不同的消毒時間（3 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min），最后用無菌水沖洗5 次. 收集第5次清洗后的無菌水0.1 mL 涂布至PDA 與LB 培養基進行培養，同時將經表面消毒過的油樟組織在空白平板內反復按壓幾次培養，26 ℃恒溫箱中培養5天，以此檢測表面消毒是否徹底. 根據以上試驗結果確定的適宜消毒劑，參照李軍勤[10]等在對南方紅豆杉內生真菌分離時的表面三步消毒法設計選擇表面消毒方式，并對確定的表面消毒方式進行優化，從而確定不同油樟樣品最佳消毒方法.

（3）培養基配方設計

試驗選用6種經典培養基與2種特色培養基，分別為PDA、MEA、Czapek-Dox Agar、Martin Medium、TTC Lecithin Tween 80 Nutrient Agar、CMA，油樟浸提液+PDA 與胡蘿卜汁+PDA，各培養基的配制方法根據其培養基說明書步驟配制，其中油樟浸提液+PDA 與胡蘿卜汁+PDA 培養基溶劑分別為，油樟浸提液50 mL+純凈水950 mL 與胡蘿卜汁50 mL+純凈水950 mL，同時在培養基倒平板過程中，為防止細菌污染，待溫度冷卻到45 ℃左右，加入0.1 g/L氯霉素.

（4）接種、培養與觀察

以夏季油樟根、莖、葉為樣品，通過試驗確定的消毒方法消毒，用無菌剪刀將周圍組織裁剪丟棄，選用中部組織將根與莖剪成（2～3）mm 的斜口小段，將葉剪切成（0.5×0.5）cm 大小的組織片，接種到8 種培養基中，每種培養基接種10 個平板50 個樣. 置于霉菌培養箱中22 ℃培養，培養一周后，再進行分離純化，統計出菌數量和種類，從而選擇出合適的培養基進行油樟其它季節根莖葉內生真菌的分離和純化，選出最佳的適宜油樟根莖葉內生真菌生長的培養基. 數據結果用Excel 與Orijin2019b 軟件進行處理分析.

（5）內生真菌的鑒定

①DNA 提取：利用真菌DNA 提取試劑盒提取DNA，以真菌通用引物ITS1(5′-TC-CGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和ITS4(5′-TC-CTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物，擴增ITS 保守區域.PCR 反應體系包括：2 μL DNA 模板、1μL ITS1（10 mM）、1μL ITS4（10 mM）、25μL2×Taq PCR Master-Mix、21μL ddH2O.

②PCR 擴增：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性35 s，58 ℃退火55 s，72 ℃延伸45 s，共45 個循環，72 ℃再延伸10 min. PCR 產物用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測. 然后送檢上海生工生物工程技術服務有限公司測序. 測序結果在NCBI-BLAST 網站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）對菌種進行分屬鑒定.

2 結果與分析

2.1 表面消毒劑種類及表面消毒方式的選擇與優化

表1 顯示，通過不同時間的表面消毒后，單獨使用次氯酸鈉或者酒精的處理，第5 次無菌水沖洗液接種到固體平板，或者用消毒后油樟組織按壓固體平板后都有菌落長出，表明表面消毒不徹底；將95%的酒精與一定濃度的次氯酸鈉結合消毒的效果較優，試驗平板無菌落生長，表明表面消毒徹底. 因此，95%的酒精和一定濃度的次氯酸鈉搭配使用時，才能完全達到表面消毒的要求.

表1 不同消毒劑對油樟組織的消毒效果Table 1 Effect of different disinfectants on the tissue of Cinnamomum longepaniculatum

根據表1 的結果，設計三步消毒法（表2）. 通過表2 的三步消毒法對油樟根、莖、葉組織進行表面消毒，結果（表3）顯示，95%的酒精+3%次氯酸鈉處理在試驗規定的時間內均無法達到徹底消毒的目的；在95%的酒精+5%次氯酸鈉處理中，消毒效果較好，在后續試驗中將采用該方式進行消毒. 然而，這種方式消毒后的油樟莖、葉組織出現褐化，可能有消毒強度太大的可能，表明對于油樟的不同組織，需在消毒時間和次氯酸鈉濃度方面再作進一步的優化.

表2 油樟組織表面三步消毒法Table 2 Surface three-step disinfection of Cinnamomum longepaniculatum tissue

表3 不同表面消毒方式的消毒效果Table 3 Disinfection effect of different surface disinfection methods

不同濃度次氯酸鈉不同消毒時間對油樟組織根、莖、葉的表面消毒效果如表4、5、6 所示. 試驗表明，根、莖、葉消毒效果分別以“GXDF11”“JXDF5”“YXDF4”最佳，即“以5%次氯酸鈉震蕩洗滌5 min”處理油樟根效果最佳，“以4%次氯酸鈉震蕩洗滌5min”處理油樟莖效果最，“以4%次氯酸鈉震蕩洗滌4 min”處理油樟葉效果最佳.

表4 不同濃度次氯酸鈉對根處理不同時間的表面消毒效果Table 4 Surface disinfection effect of root treated with different concentrations of sodium hypochlorite at different times

表5 不同濃度次氯酸鈉對莖處理不同時間的表面消毒效果Table 5 Surface disinfection effect of stem treated with different concentrations of sodium hypochlorite at different times

表6 不同濃度次氯酸鈉對葉處理不同時間的表面消毒效果Table 6 Surface disinfection effect of leaf treated with different concentrations of sodium hypochlorite at different times

2.2 培養基的篩選

以夏季油樟樣本為材料篩選內生真菌培養基的結果如表7 所示，結果表明：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的分離效果最佳，麥芽浸粉瓊脂培養基與卵磷脂吐溫-80營養瓊脂培養基也具有良好的培養能力.

表7 夏季油樟組織內生真菌在8種培養基上的培養結果Table 7 Culture results of Endophytic Fungi from summer Cinnamomum longepaniculatum tissue in eight media

以篩選出的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、麥芽浸粉瓊脂培養基、卵磷脂吐溫-80 營養瓊脂培養基再對春、秋、冬三個季節的油樟組織進行內生真菌培養，不同季節油樟組織在三種培養基上培養的內生真菌的總菌落數與種數見圖1 和圖2. 由圖可知，總體上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基優于麥芽浸粉瓊脂培養基與卵磷脂吐溫-80營養瓊脂培養基.

圖1 不同季節油樟組織在3種培養基上培養的內生真菌總菌落數Fig.1 Total colonies of endophytic fungi cultured on Cinnamomum longepaniculatum tissue in different seasons from three media

圖2 不同季節油樟組織在三種培養基上培養的內生真菌種數Fig.2 Number of endophytic fungi cultured on Cinnamomum longepaniculatum tissue in different seasons from three media

3 討論

在分離植物內生真菌時，表面消毒條件是最關鍵因素之一，如果表面消毒條件掌握不當，會導致雜菌污染或部分內生真菌被殺死. 表面消毒方法的選擇直接影響樣本內生真菌的分離效果、樣本表面消毒是否徹底、樣本是否褐化，還可能影響油樟組織內生真菌生長. 要確保樣本表面消毒效果以及保護內生真菌不受損傷，選擇合適的表面消毒劑、確定合適的消毒方式且設定適宜的消毒劑濃度以及消毒時間尤其重要[11].本文以油樟根、莖、葉為材料，全面分析了油樟各組織的表面消毒方法，發現油樟根、莖、葉的消毒效果分別以“GXDF11”“JXDF5”“YXDF4”最佳，即“以95%酒精浸泡清洗材料1 min，5%次氯酸鈉震蕩洗滌5 min，再95%酒精浸泡清洗材料1 min處理油樟根；以95%酒精浸泡清洗材料1 min，4%次氯酸鈉震蕩洗滌5 min，再95%酒精浸泡清洗材料1 min 處理油樟莖；以95%酒精浸泡清洗材料1 min，4%次氯酸鈉震蕩洗滌4 min，再95%酒精浸泡清洗材料1 min 處理油樟葉”后無污染，分離的內生真菌種類與數量最多. 這表明采用不同消毒劑與不同的消毒時間對油樟不同組織表面消毒的效果都有影響，對不同的油樟組織采用不同的表面消毒方式能更好的保證油樟組織的內生真菌分離效果，該結果與李軍勤[10]研究南方紅豆杉內生真菌分離時的表面消毒方法，并發現消毒劑的處理時間對于從植株不同組織器官分離內生菌非常關鍵的結果一致. 對油樟的根、莖、葉表面消毒時所用的次氯酸鈉濃度及時間不一，這可能與組織的密度、組織厚度以及表面結構相關. 該研究結果可為研究不同樣本表面消毒提供參考依據.

培養基是給所培養微生物提供生長所必須的營養與環境條件，不同種類的培養基其營養物質的濃度與配比以及pH條件不同，因此選擇最適宜的培養基對從功能豐富的油樟中分離出更多的內生真菌、研究其多樣性以及篩選出功能特異的內生真菌具有重要研究意義與應用價值. 王娜[12]在分析4 種培養基對人參內生真菌的培養情況后發現PDMA 培養基最適，表明選擇正確的培養基對實驗結果尤其重要. 目前關于油樟內生真菌分離培養的最適培養基篩選未見報道. 本文通過選擇6 種最常見的真菌培養基與兩種特色培養基分離培養四季油樟組織的內生真菌，對比分離的內生真菌總菌落數與菌種數，結果顯示馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基為分離油樟內生真菌的最優培養基，其次為麥芽浸粉瓊脂培養基與卵磷脂吐溫-80營養瓊脂培養基.從結果還可看出，春季油樟組織的內生真菌種數最多，而夏季油樟組織內生真菌種數最低，這可能與溫濕度有關，可能油樟組織中生長的內生真菌為低溫性菌種. 這一結果可為研究油樟內生真菌的多樣性與功能提供支撐與基礎.