滇水金鳳LWD基因的克隆及表達分析

李新藝　李洋　羅超　魏春梅　黃美娟　瞿素萍　黃海泉

摘? 要：WD40是轉錄因子大家族，具有調節花青素苷生物合成、植物生長發育及非生物脅迫響應等功能，（LIGHT-REGULATED WD）基因是該家族中已知的生物鐘調節因子，但目前有關植物基因的報道較少，其功能還有待深入研究。為探究基因對滇水金鳳花色的影響，本研究以滇水金鳳花器官為材料，采用RT-PCR等技術克隆得到2個滇水金鳳基因，分別命名為和，其cDNA全長分別為1041 bp和1032 bp，分別編碼347個和344個氨基酸。基本理化性質分析顯示，和的GC含量分別為46%和50%，相對分子量分別為38?838.47?kDa和39 029.65 kDa，理論等電點分別為4.71和4.70。IuLWD1和IuLWD2的不穩定指數分別為53.60和52.58，均屬于不穩定蛋白;其總平均親水指數分別為?0.388和?0.366，均為親水性蛋白。結構域分析顯示，IuLWD1和IuLWD2均含有6個典型的WD40-repeat保守結構域，屬于WD40超家族。多序列比對發現，IuLWD1和IuLWD2氨基酸序列與牡丹、葡萄及楊梅等氨基酸序列相似度較高。系統發育分析表明，IuLWD1與葡萄和牡丹聚為一支，同源性達85%;IuLWD2與楊梅聚為一支，同源性達90%，然后共同聚類在一支，推測2個基因為旁系親緣關系。qRT-PCR分析表明，和基因在4種不同花色滇水金鳳及其4個不同發育階段均有表達，均以深紅色表達量最高，白色表達量最低，2個基因的表達量均與花色呈正相關，且基因的表達量高于基因的表達量，表明和基因均在滇水金鳳花色素苷的生物合成中發揮了作用，且基因對滇水金鳳花色形成的調控作用更強。該研究結果為進一步探究滇水金鳳花色形成及變異機理、鳳仙花花色改良及新品種培育奠定基礎。

關鍵詞：滇水金鳳;基因;花色;表達分析中圖分類號：S681.1 ?????文獻標識碼：A

Cloning and Expression Analysis of Genes in

LI XinyiLI YangLUO ChaoWEI ChunmeiHUANG MeijuanQU SupingHUANG Haiquan

1. College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences， Southwest Forestry University / Southwest Research Center for Engineering Technology of Landscape Architecture， State Forestry and Grassland Administration / Yunnan Engineering Research Center for Functional Flower Resources and Industrialization / Research and Development Center of Landscape Plants and Horticulture Flowers， Southwest Forestry University， Kunming， Yunnan 650224， China; 2. Flower Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan 650205， China

WD40 is a large transcription factors family， which has the functions of regulating anthocyanin biosynthesis， plant growth and development， abiotic stress response and so on. （LIGHT-REGULATED WD） gene is a known biological clock regulator in this family， but there are few reports about plant gene at present， and its function needs further study. In order to investigate the influence of gene on the flower color of ， two genes of were cloned by RT-PCR and other techniques， named and respectively. The full-length cDNA were 1041 bp and 1032 bp， encoding 347 amino acid and 344 amino acid respectively. The analysis of basic physical and chemical properties showed that the GC content of 1 and 2 was 46% and 50%， respectively; the relative molecular weight of and was 38 838.47 kDa and 39 029.65 kDa respectively; the theoretical isoelectric point of IuLWD1 and IuLWD2 was 4.71 and 4.70 respectively. The unstable index of IuLWD1 and IuLWD2 was 53.60 and 52.58， respectively， indicating that both proteins were unstable proteins. The total average hydrophilic index of IuLWD1 and IuLWD2 was ?0.388 and ?0.366， respectively， indicating that both proteins hydrophilic proteins. The analysis of domains showed that both IuLWD1 and IuLWD2 contained six typical WD40-repeat conserved domains， indicating that IuLWD1 and IuLWD2 belonged to WD40 superfamily. Sequence alignment showed that the amino acid sequence of IuLWD1 and IuLWD2 was similar to those of ， and . Based on the phylogenetic analysis， it showed that IuLWD1 was clustered with and ， and the homology reached 85%; the IuLWD2 and were clustered into one branch with 90% homology， and then they clustered together. It was inferred that the two genes were collateral relatives. According to the analysis of qRT-PCR， and were expressed in four different flower colors and four different development stages of ， the highest expression level was in the deep-red flower， and the lowest expression level was in the white-flower among all tested different colors. The expression level of both genes was positively correlated with flower color， and the expression level of was higher than that of ， which indicated that both and played an important role in the anthocyanins biosynthesis of ， and played a stronger role in regulating the flower color formation of . The above results established a foundation for further exploring the formation and variation mechanism of the flower color of ， improving the flower color of and cultivating new species.

; gene; flower color; expression analysis

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.007

花色是觀賞植物最重要的性狀之一，也是植物自然進化過程中最具適應意義的表型性狀。目前國內外已有許多關于植物花色的研究，包括花色素苷結構、花色變異機理、花色成色機理等方面。不同植物的花色形成機理并不完全相同，其中花色素苷的合成代謝對植物花色的影響最為直接。而決定花色素苷合成的基因主要包括結構基因和調節基因，結構基因編碼參與花青素苷生化反應的合成酶類，如、、等;調節基因編碼的轉錄因子則可決定結構基因表達與否以及表達的強弱，如WD40、MYB、BHLH等。其中WD40是真核生物中的大家族，具有調節花青素苷生物合成、植物生長發育、非生物脅迫響應等功能，且WD40的重復結構域具有提高與其他蛋白互作的能力。植物花色素苷的合成除了由基因調控還受到周圍環境的影響，如光照、溫度和激素等，其中光是影響植物花青素苷生物合成的最重要的環境因子之一，且光可以通過光信號影響與花青素苷合成相關基因的表達。WD40亞家族的和基因在擬南芥的光周期途徑中起著重要的作用，并調節光周期感知的輸出基因的正確的表達，并且植物的光受體感知光信號后，會進一步調控下游轉錄因子的表達，從而促進或抑制結構基因的表達，最終影響植物中花青素的合成。有研究表明在強光下花青素苷的積累量顯著提高，但在弱光或黑暗條件下相關基因的表達被下調或抑制，使植物花青素苷的含量下降，從而產生白色或淺色器官。在擬南芥中，進行藍光處理或過量表達或的轉基因植株均能促進花青素積累。強光可以增加蘋果的表達，上調下游基因的表達，促進果皮中花青素的積累;由、和組成的MYB-bHLH- WD40復合物可在強光下觸發番茄果實中不均勻的花色苷積聚。已有研究表明與和基因同屬一個亞族的基因除了參與擬南芥花青素苷的調控，還具有調節擬南芥光周期的功能;和基因作為已知的生物鐘調節因子，其是否在植物花青素合成調控中起作用尚不明確，有待深入研究。

滇水金鳳（ ）是鳳仙花科鳳仙花屬一年生或多年生的中國特有植物，主要分布于中國西南地區，其花繁色艷、花期長、抗性強、生物量大，具有較高的觀賞價值，并廣泛應用于滇池等濕地建設。本研究以滇水金鳳為材料，通過RT-PCR等技術對基因進行克隆，并對其序列結構、系統發育進行分析;再通過qRT-PCR分析其在不同花色及不同花發育時期中的表達情況，以期進一步了解基因在滇水金鳳花色苷合成途徑中的作用。

? 材料與方法

? 材料

滇水金鳳采自昆明市撈魚河濕地公園，其中紅色為野生型，另有白色、粉色和深紅色為突變型，樣品采集后于液氮速凍，再置于?70℃冰箱中備用。以紅色滇水金鳳花器官為材料進行目的基因的克隆，以滇水金鳳4種不同花色及其4個不同花發育時期（S1花苞期、S2始花期、S3盛花期、S4謝花期）的花器官來檢測目的基因的相對表達量（圖1）。

方法

1.2.1 ?滇水金鳳總RNA的提取與基因的克隆? 采用RNA提取試劑盒（OMEGA）提取滇水金鳳花器官總RNA;參照逆轉錄試劑盒（全式金）將RNA逆轉錄為cDNA，最后置于?20℃中備用。

根據轉錄組數據設計和的特異性引物（本研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。引物：IuLWD1F（5￠-ATGGTGGCGAGAAGCGACCAGAAC-3￠）、IuL-WD1R（5￠-TCATACCCTAAGAATTTGAAG-C-T-TACTAGAG-AAG-GC-3￠）;IuLWD2F（5￠-AT-G-G-TG-GC-G-AGCAGTGACCCGAACCAAGATG-3￠）、IuL-W-D2R（5￠-TCATACCCTCAGGATTTGAA-GC-T-TA-CTAGAG-3￠）。以紅色滇水金鳳cDNA第一鏈為模板進行基因的cDNA擴增。PCR反應總體系為20.0 μL，其中d N T P M i x t u r e 1.6 μL，1 0′B u f f e r（M g）2.4 μ L，E a s y T a q D N A P o l y m e r a s e 0.2?μ L，上下游引物各1.0 μ L，模板1.0 μ L，最后用d d HO補足。PCR反應程序：95℃ 5?min;95℃ 50?s，59℃（1）/64℃（2） 30?s，72℃ 1?min，35個循環;72℃ 10?min，4℃ 10?min。膠回收后連接載體并轉化大腸桿菌，挑菌驗證后進行測序。

1.2.2? 基因生物信息學分析? 使用Expasy分析和的基本理化特性;運用NCBI的CDD工具預測目的基因結構域;采用BLAST工具于NCBI中查找同源序列，并用DNAMAN 6.0軟件進行序列比對;利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.2.3? 基因的時空表達模式分析 ?分別提取4種不同花色及4個不同花發育時期的滇水金鳳花器官總RNA，然后逆轉錄成cDNA。和基因的qRT-PCR引物：qIuLWD1F（5￠-GAGACAGAACCGAAGCGAGT-3￠）、qIuLWD1R（5￠-CCGAGTCGAACCAAAGGAGT-3￠）;qIuLWD2F（5￠-AAGATGGTTCCGACGAGCAA-3￠）、qIuLWD2R（5￠-GAGGTCAGGCTTCTGGCATT-3￠）。qRT-PCR的內參基因為：ActinF（5￠-TGAATGTC-C-CT-GCTGTTTG-3￠）、ActinR（5￠-ACCTTCCGC-AT-A-ACTTTACC-3￠）。采用2法計算基因相對表達水平，每個樣品進行3個重復，將花苞期定義為1個單位作為對照，對目的基因在4種不同花色及4個不同花發育時期的表達量進行qRT-PCR分析，并用SPSS軟件進行顯著性分析。

? 結果與分析

滇水金鳳基因的基本理化性質及保守域分析

在滇水金鳳轉錄組數據的基礎上設計特異性引物，以滇水金鳳的cDNA為模板，通過RT-PCR克隆獲得2條LWD基因片段，與轉錄組序列無差異，分別命名為和（圖2）。

運用ExPasy-ProtParam對滇水金鳳基因進行分析，和全長分別為1041?bp和1032?bp，分別編碼347和344個氨基酸。GC含量分別為46%和50%;原子總數分別為5398和5424;相對分子量分別為38 838.47?kDa和39?029.65 kDa;理論等電點分別為4.71和4.70。不穩定指數分別為53.60和52.58，均屬于不穩定蛋白。總平均親水指數分別為?0.388和?0.366，均為親水性蛋白。運用CDD進行結構域分析，結果顯示IuLWD1和IuLWD2蛋白均含有6個典型的WD40-repeat保守結構域，推測IuLWD1和IuLWD蛋白屬于WD40超家族（圖3）。

? 滇水金鳳基因的系統進化分析

運用DNAMAN軟件對源自不同物種的基因進行氨基酸同源序列比對分析，結果表明，滇水金鳳IuLWD1與其他植物具有較高的同源性，約85%，如芍藥科的牡丹（AIU98519.1）和葡萄科的葡萄（NP_001268006.1）等;IuLWD2與其他植物也具有較高的同源性，約90%，如楊梅科的楊梅（KAB1200607.1）和楊柳科的毛果楊（XP_002321066.1）等。此外，IuLWD具有WD40家族典型的WD repeats保守結構域，并且序列比對結果表明源自不同物種的LWD氨基酸序列在某些區域是高度保守的（圖4）。運用Neighbor- Joining法，Bootstrap值為1000，根據IuLWD氨基酸及其同源氨基酸序列構建系統發育樹，結果發現IuLWD1與葡萄和牡丹聚為一支，IuLWD2與楊梅聚為一支，然后共同聚類在一支，IuLWD1和IuLWD2并未直接聚在一起，推測二者為旁系親緣關系（圖5）。

? 滇水金鳳基因的表達分析

結果表明，和基因在滇水金鳳4種不同花色及其4個不同花發育時期的花器官中均有表達，且均在深紅色滇水金鳳表達最高，其次是紅色和粉色滇水金鳳，而在白色滇水金鳳中表達最低，其表達量均與滇水金鳳花色呈正相關，這在一定程度上說明二者功能較類似。其中基因在白色花器官中的表達量無明顯波動，僅S1～S2和S3～S4階段有顯著性差異;在粉色花器官中，S1～S3階段的表達量顯著上升，S4階段的表達量幾乎為0;在紅色花器官中，表達量在S3（盛花期）階段達到峰值，約為S1階段的6倍，與其他階段的表達量均呈現顯著性差異;在深紅色花器官中S2（始花期）階段表達量最高，是S1階段的14.5倍左右，而后呈下降趨勢，4個階段的表達量均呈現顯著性差異。基因在白色滇水金鳳中的表達量均顯著低于S1（花苞期）階段，呈現先下降后上升的趨勢;在粉色滇水金鳳中基因在S2階段（始花期）表達量最高，約為S1階段的2倍，4個階段均有顯著性差異;紅色和深紅色滇水金鳳中的S1～S3階段顯著升高，并在S3（盛花期）階段達到峰值，分別為S1階段的2倍和3倍左右，S4階段表達量幾乎為0（圖6）。綜上所述，隨著花發育時期的推移，除了白色滇水金鳳中基因表達量，在4種不同花色滇水金鳳中基因的表達量均呈先上升后下降的趨勢，推測基因參與了滇水金鳳花色的調控;并且基因的表達量高于基因，可能基因在滇水金鳳中的調控能力弱于基因。

?討論

WD40作為轉錄因子的大家族，其結構高度保守，并具有多種生理生化功能。本研究基于滇水金鳳轉錄組數據，成功克隆了滇水金鳳WD40家族的和基因，其cDNA全長分別為1041 bp和1032 bp，分別編碼347 aa和344?aa，均屬于親水性不穩定蛋白;均不含內含子，這與WU等的結果一致。結構域分析發現2個基因均具有典型的WD-repeat保守結構域，且WD基元數量均為6個，推測IuLWD1和IuLWD2蛋白屬于WD40超家族。然而，在IuLWD1和IuLWD2蛋白中，除了WD重復序列外，沒有已知的蛋白結構域被識別，IuLWD1和IuLWD2在滇水金鳳中的具體作用方式還有待進一步探究。TTG1與LWD1和LWD2屬于同一個WD40亞族，且TTG1是表皮細胞分化和色素產生的調節因子，最近的研究表明TTG1也參與擬南芥的生物鐘調節;而LWD1和LWD2是已知的生物鐘調節因子，推測其與同亞族的TTG1存在部分功能交叉，也對植物花色素苷的合成有一定的影響。通過系統發育樹分析發現，滇水金鳳IuLWD與牡丹、葡萄和楊梅聚類在同一支上，進化關系更近;有研究表明牡丹的40基因與花青素合成調控有關，推測滇水金鳳的基因可能也參與了其花色素苷合成的調控。而且LWD1和LWD2在多種生物體中的流行意味著這些蛋白質普遍參與生長和（或）發育過程，但是大多數生物體中該基因的生物學功能的報道仍然有限，因此，滇水金鳳和基因的克隆及表達分析有望為這些同源蛋白的功能闡明提供線索。對4種不同花色及4個不同花發育時期的滇水金鳳花器官進行qRT-PCR分析發現，和基因均是在深紅色滇水金鳳中表達量最高，白色滇水金鳳中表達量最低，且2個基因的表達量均與花色呈正相關，可以推測和均在滇水金鳳花色素苷的生物合成中發揮作用，并且2個基因存在功能冗余;但基因的表達量要高于，猜測基因對滇水金鳳花色形成的調控作用強于基因。目前許多植物的花色表型變化及與花色形成相關基因的表達調控模式仍有待進一步研究，基因是和1一樣通過與其他轉錄因子相結合共同調控花色素苷的合成還是通過調節其他的基因從而間接調控花色素苷的合成，還有待進一步的研究。

基因在深紅色滇水金鳳中的高表達及白色滇水金鳳中的低表達，表明該基因的表達量在一定程度上正向調控滇水金鳳花色， qRT-PCR結果也進一步表明該基因可能參與滇水金鳳花色素苷的合成，并在花色素苷的合成調控中發揮作用。上述結果為后續鳳仙花花色遺傳改良及新品種培育提供基礎數據和科學依據。

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