SSR 標記熒光毛細管電泳在種子檢測中常見問題分析

李巧英

（山西省種業發展中心，太原 030006）

分子標記技術是近年來發展較快的基因檢測技術，隨著新標記方法的開發和試驗技術的改進，在基因水平上檢測農作物種子信息逐漸成為監控種子質量的一個重要手段。由于分子標記法不受自然條件和表現性狀的約束，實現了種子品種遺傳信息室內快速檢測，受到大家的青睞。SSR 作為第2 代分子標記方法，是一種共顯性標記，具有重復性好、等位變異多、數據分析簡便、易操作等優點，在農作物種子質量檢測中被廣泛使用。

熒光毛細管電泳技術將熒光檢測的高靈敏度和毛細管電泳的高效性結合，利用電泳和電滲流的電動力學原理，在毛細管中灌滿膠分離PCR 產物，檢測熒光信號，數據軟件分析系統將其轉化成峰圖，顯示試驗結果。該技術自動化程度高，檢測通量高，試驗操作簡單，數據統計程序化，避免人為估算的主觀性，結果精確到1bp[1]，直接顯示擴增產物片段的大小，實現了指紋圖譜與堿基序列長短之間的對應轉換，易于實驗室間結果比對，常用GeneMapper和GeneMarker 分析SSR 擴增片段[2]。本文就試驗中遇到的熒光信號強度、特異峰型的統計分析以及毛細管電泳儀運行和維護、試驗結果與數據庫比對等問題進行分析，為SSR 分子標記熒光毛細管電泳檢測農作物種子質量試驗技術標準化提供參考。

1 均一熒光信號采集的保證

SSR 分子標記熒光毛細管電泳采集熒光信號作為試驗數據的基礎，嚴格要求模板DNA 濃度和擴增體系的配置比例，避免不同樣品孔間熒光信號強弱差異大帶來干擾。擴增前將模板DNA 原液稀釋至濃度一致；擴增體系按照引物、模板、酶最佳配比設置。優質的DNA 和完美的擴增體系結合可以打造一套高質量的品種信息指紋圖譜，獲得準確可靠的試驗數據。

電泳過程中，為確保采集到的熒光信號真實可信，要求擴增板每個樣品孔內PCR 產物獨立有效，封口的膜和封膜技術是關鍵。封板膜要求均勻透光，有一定的韌性，電泳儀能清晰獲取熒光信號，且膜將樣品孔密封，形成互不干擾的PCR 微循環環境。通常采用熱封或激光封膜，防止PCR 產物蒸發損失和樣品間的交叉污染，保證PCR 產物的獨特屬性和檢測結果準確有效。

2 特異峰型的統計分析規律

電泳結束，分析軟件將檢測結果繪制成峰圖展示出來，統計分析各位點的特異峰，自動過濾非特異峰。理想的特異峰（圖1a 左）為獨立的單峰，峰型尖銳鋒利，周圍有若干小峰；非特異峰（圖1a 右）偏矮胖，峰較低，不作統計。實際檢測中會遇到不同的峰型，有連續峰（圖1b）、高低峰（圖1c）、n+1 峰（圖1d）、多峰（圖1e，f）、pull-up 峰[2-3]等情況。連續峰（圖1b）多由幾個相差2bp 的峰群組成，以較高的峰或最右邊的峰大小為試驗結果，統計為單峰，避免識別為多峰；遇到高低峰（圖1c）時，通常讀取較高峰的數值，或比對數據庫中參照樣品峰型的統計規律；n+1 峰（圖1d）在試驗中比較常見，即同一位置出現2 個峰，相差1bp，作為單峰計算，識別較高峰的數值；多峰（圖1e，f）在混樣檢測時出現，首先要確定是由于樣品混雜引起的多峰，還是此品種在該位點的特異屬性，需要采用單粒提取DNA，重新擴增，證實多峰的屬性，當多峰為特異峰時識別最高的峰。pull-up 峰是一種干擾峰，在多重熒光電泳時，由于某色熒光引物的特異峰在某個位置較高，把這個位置其他色熒光引物的峰連帶升高而產生，統計分析時剔除。

圖1 熒光毛細管電泳峰圖類型

3 數據統計與指紋數據庫比對

數據統計時，先分析分子量內標（LIZ）、參照樣品和空白對照的峰型，LIZ 峰型準確，參照樣品數據與指紋數據庫一致，空白對照中無明顯的特異峰，則表明試驗準確，數據可采納。試驗中可選擇合適的LIZ，用LIZ校正等位基因峰值，SSR分子標記屬于短串聯重復，DNA 片段較短，如玉米種子真實性檢測SSR 分子標記等位基因位于100～430bp 之間[4]，可選用LIZ500 作為分子量對照。參照樣品一般選擇常見的指紋穩定且具有特異峰型的品種，設置參照樣品用于校正不同試驗批次的指紋數據，提取有效峰值并將數據整合標準化。空白對照用于檢測試劑耗材和試驗環境是否被污染，以確定試驗結果的可靠性。

試驗數據與指紋數據庫比對時，需要比較特異峰的位置及峰型。參照樣品的峰圖與指紋數據庫中的數據吻合，待測樣品與參照樣品采用統一的讀數規則計數，數據整理后，上傳指紋數據庫比對[5]。同名品種比較，確認待測樣品品種的真實性；與全庫品種比較，識別待測樣品的身份，比對過程中，個別差異位點需要人工確認。

4 毛細管電泳儀的運行與維護

毛細管電泳儀的運行環境溫度適宜保持在24±2℃，室溫太高毛細管內溫度升高，會使溶液黏度下降，電滲速度增大；室溫太低，加溫爐升溫慢，影響電泳速率和分離效果，適宜的檢測溫度可保證試驗結果的準確性。電極槽倒入緩沖液，兩極插入緩沖液中，電泳通路保持濕潤，如果干燥，會導致毛細管堵塞，影響電泳。儀器運行時各級連接口密封，避免進入空氣，氣泡會阻斷電流，產生放電，損壞密閉的電泳通路，如有氣泡，用凝膠把系統中的氣泡排出。進樣前經專用洗液清洗毛細管和連接管路，保證電泳通道暢通。正式電泳時，毛細管進口端連接凝膠，用新膠灌注毛細管，暫時不用時可以用清洗液浸沒凝膠入口。

5 小結

SSR 分子標記熒光毛細管電泳檢測方法在農作物種子質量檢測中的應用實現了快速高效檢測，數據統計標準化、規范化，解放了人力，減少了人員誤差，并且試驗結果準確，精確度高[6]，可以單獨檢測待測樣品，結果與數據庫比對。綜上所述，解決好試驗中遇到的問題，能夠大大提高檢測效率，適應當前種子市場管理的需要，為農作物種子質量監測提供一個可靠的檢測平臺。