轉基因抗蟲棉種子室內篩選

張 文 劉銓義 馮 楊 逯 濤 王國平 王海娟

（新疆生產建設兵團第七師農業科學研究所，奎屯 833200）

棉花是一種重要的天然植物纖維，也是重要的經濟作物。我國是世界上生產、消費與進口棉花最多的國家[1]，因此棉花在我國農業生產中占據十分重要的地位。近些年來，由于氣候條件、生態環境、耕作制度以及種植業結構的改變，農業害蟲抗藥性不斷增加，棉田害蟲為害特別是棉鈴蟲的為害日益嚴重，棉鈴蟲種群數量總體上呈增加趨勢[2]?；瘜W防治是抑制棉鈴蟲為害的重要手段，雖然該種方法抑制效果好，但會對環境造成嚴重污染，更關鍵的是長期使用化學殺蟲劑極易使棉鈴蟲產生抗藥性，導致實際生產中化學防治效果甚微[3-4]。隨著科技的不斷發展，我國開始推廣種植轉基因抗蟲棉，由于其能很好地控制棉鈴蟲的發生，種植區域不斷擴大，到2017 年全國轉基因抗蟲棉的種植面積約280 萬hm2[5]。

轉基因抗蟲棉是推動我國棉花產業快速發展的重要舉措，建立一種簡單、方便、快速的轉基因棉花檢測與鑒定方法是促進其發展的關鍵[6]?？敲顾乜剐曰蚴悄壳爸参镞z傳轉化中應用最早和最廣泛的一種選擇標記基因，通過阻斷非轉化植株葉綠體蛋白質的合成，促使植株白化來達到鑒定與篩選的目的。李雪林等[7]發現利用卡那霉素溶液浸種萌發法可更加簡便、大量、快速地鑒定與篩選出轉基因棉花植株。趙俊俠等[8]研究發現將棉種浸泡于150mg/L 卡那霉素中，2～4d 后根據種子萌發長度可進行轉基因抗蟲棉的篩選。呂孟雨等[9]研究認為采用卡那霉素溶液浸種是一種經濟有效且準確可行的篩選含有npt-II 基因的轉基因棉花材料的方法。也有學者研究發現，田間卡那霉素篩選是一種快捷的棉花轉基因鑒定與篩選方法，但可靠性低，準確率只有20%[10]。此外，田間一株一葉涂抹不僅工作量繁重，也極易受天氣環境和人為操作的影響，從而造成鑒定結果假陽性偏多[11]。PCR 技術也是最主要的轉基因檢測技術之一[12]，但PCR 法較復雜，不但需要昂貴的儀器設備和專業的技術人員，且耗時較久，抽樣量、抽樣面積小也易導致漏檢，不適合大規模篩查和現場即時檢測。隨著科學技術的發展，轉基因試紙條技術應運而生。寧新民等[13]提出，試紙條檢測法是一種十分有效的外源抗蟲基因檢測手段。張欣等[14]采用轉基因試紙條法與熒光定量PCR 法對大批量稻谷和大米樣品進行檢測，2 種方法檢測結果基本一致。Mutoni 等[15]用試紙條法和PCR 法檢測了115 份玉米樣品，結果顯示PCR 法與蛋白質試紙條法的檢測結果完全一致。因此，本研究通過轉基因試紙條法和卡那霉素室內浸種法，摸索出一種簡單、方便、快速、準確的鑒定轉基因棉花的方法來滿足轉基因種子的鑒定與篩選需要。

1 材料與方法

1.1 供試材料轉基因抗蟲棉材料為魯棉研24 號母本和魯棉研24 號父本，由北京中農金科種業科技有限公司提供；非轉基因材料為國審棉Z1112 和新審棉Z1146，由新疆生產建設兵團第七師農業科學研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉基因試紙條檢測法選用浙江托普云農科技股份有限公司（靈敏度1%）、上海佑隆生物科技有限公司（靈敏度1%）和奧創生物技術（山東）有限公司（靈敏度2ng/mL）生產的轉基因試紙條進行轉基因檢測。將20 粒種子磨碎至粉末狀后，按照說明書的步驟進行樣本處理和檢測，一般5～10min 可出結果。

陽性（有轉基因）即在檢測試條的檢測區及質控區出現兩條紫紅色條帶，即一條檢測線和一條質控線。陰性（無轉基因）表現為僅在檢測試條的質控區出現一條紫紅色質控線。

1.2.2 卡那霉素浸種法供試藥劑為100 萬單位（1g/mL）的硫酸卡那霉素注射液，由河北遠征禾木藥業有限公司生產。用蒸餾水將硫酸卡那霉素注射液分別配成0mg/L（蒸餾水）、2500mg/L、5000mg/L、7500mg/L 的溶液，將供試的4 種棉花種子各取60粒，3 個重復，分別浸泡在不同濃度的硫酸卡那霉素溶液中，放入28℃恒溫發芽培養箱中浸種48h，然后進行瀝干催芽8h，觀察棉種發芽情況。將種子按照常規沙培發芽試驗的方法播種，放入28℃恒溫發芽培養箱中，于播種后10d 觀察側根生長情況。

1.3 數據分析采用WPS office 軟件進行數據處理和制表。

2 結果與分析

2.1 轉基因試紙條檢測選用非轉基因材料Z1112、Z1146 和轉基因抗蟲棉魯棉研24 號父本、魯棉研24 號母本為材料，用3 個品牌的Bt-CryI Ab/Ac 試紙條對其進行檢測，結果（圖1）顯示3 個品牌的試紙條檢測結果完全一致，均能快速、準確地檢測出非轉基因材料和轉基因抗蟲棉材料，且準確率達到100%，說明轉基因試紙條法是一種簡單、快捷、準確的轉基因抗蟲棉篩選方法。

圖1 3 種轉基因試紙條對不同棉花品種的檢測結果

2.2 硫酸卡那霉素溶液浸種后的發芽情況由表1 可知，以不同濃度硫酸卡那霉素溶液處理的轉基因抗蟲棉種子（魯棉研24 號父本和魯棉研24 號母本）浸泡后發芽率均在90%（含）以上，而非轉基因材料的種子（Z1112 和Z1146）發芽率隨著硫酸卡那霉素溶液濃度的增大而大幅度降低，當硫酸卡那霉素溶液濃度在5000mg/L 時，發芽率分別為31.7%、53.3%，濃度升至7500mg/L 時，發芽率分別僅為16.7%、31.7%。

表1 硫酸卡那霉素對棉花種子發芽情況的影響

2.3 硫酸卡那霉素溶液浸種后側根生長情況由圖2 可知，培養10d 后，不同濃度硫酸卡那霉素溶液處理的轉基因抗蟲棉均有幼苗長出側根，硫酸卡那霉素溶液濃度在5000mg/L 時，魯棉研24 號父本和魯棉研24 號母本分別有79.2%、72.4%的棉種有側根長出，當硫酸卡那霉素溶液濃度達到7500mg/L時，僅有27.9%、46.0%的棉種有側根長出。而非轉基因材料隨著硫酸卡那霉素溶液濃度的增加側根長出比率急劇下降，當硫酸卡那霉素溶液濃度在5000mg/L 時，Z1112 和Z1146 僅有5.6%、9.7%的棉種有側根長出，至7500mg/L 時，2份材料均無側根長出。因此，用5000mg/L 的硫酸卡那霉素溶液浸種48h，并持續培養10d，可根據側根發生情況有效篩選出轉基因棉花。

圖2 硫酸卡那霉素溶液處理對棉花側根長出比率的影響

3 結論與討論

對后代進行篩選和鑒定是轉基因抗蟲棉育種的首要工作，因此，建立一種快速、準確、成本低廉的轉基因抗蟲棉篩查方法十分必要。目前，關于轉基因棉花的篩選已有許多報道，大多都是在田間利用卡那霉素溶液對葉片進行涂抹，這種方法不僅工作量大，而且受季節的局限[16]。針對上述情況，有學者開始在室內利用卡那霉素進行轉基因植株的后代篩選，李雪林等[7]研究發現100mg/L 卡那霉素溶液能顯著抑制非轉基因棉種的萌發和下胚軸的伸長；經PCR 驗證，篩選出的棉種陽性率達到95%以上。王彥霞等[16]提出了3 種可在室內快速篩選與鑒定轉基因抗蟲棉的方法，但都是基于葉片對卡那霉素溶液產生的黃化反應，而且試驗的工作量也比較大?？軅サ萚17]研究發現5000mg/L 卡那霉素溶液浸種后通過觀察棉種的側根生長情況可較為準確、快速地篩選出轉基因棉花。孫鋒等[6]研究認為將棉種浸泡在濃度為4000mg/kg 的卡那霉素溶液中48h 可快速篩選出轉基因種子。本研究結果與上述結果基本類似，用5000mg/L 的硫酸卡那霉素溶液浸種48h，并持續培養10d，可有效篩選出轉基因棉花。但也有學者認為利用卡那霉素浸種法篩選轉基因種子受諸多因素影響，如:培養基質、藥劑處理方式、卡那霉素濃度、溶液體積、種子數甚至籽粒的飽滿程度、浸種時間、遺傳背景等都會對篩選效果有很大影響[18]。

本研究還進行了轉基因試紙條檢測，結果顯示3 個品牌的試紙條檢測結果完全一致，均能快速、準確地檢測出轉基因抗蟲棉材料，整個檢測過程只需要10～15min，且不需要專業的技術人員，對實驗的條件要求也不嚴格，而相對來說，卡那霉素浸種法的檢測周期更長，而且存在試驗誤差，影響試驗準確率。因此，轉基因試紙條法是一種更為快速、準確的鑒定和篩選轉基因抗蟲棉植株的方法。隨著轉基因試紙條技術的不斷成熟和發展，其有望在我國轉基因植株篩選和鑒定方面發揮更大的作用。