基于“雙抗體夾心法”全自動酶免工作站檢測方法的建立

李玉立,邵天舒,趙璇,李瀟,何歡,梅婕,李文東（北京市藥品檢驗研究院 國家藥品監督管理局創新藥物安全研究與評價重點實驗室 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室,北京 102206）

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）最早由瑞典斯德哥爾摩大學的Engvall和Perlmann于1971年建立[1]。Engvall等4位研究者基于一種非放射性標記的免疫分析技術，建立了酶聯免疫分析方法[2]。他們將抗原或抗體與酶偶聯，通過免疫熒光檢測，于1970年獲得第一個ELISA校準曲線[3]。早期的ELISA由于特異性不高而妨礙了其在實際中應用的步伐，隨著單克隆抗體技術發展，用于測量抗原的“夾心”ELISA試驗被開發出來，該方法快速、簡單且具有很好的靈敏度[4]。加之多功能酶標儀的使用，使ELISA更為簡便實用和標準化，如今ELISA方法已涉及多種細菌和病毒的檢測，被用于疾病的診斷（如HIV檢測[5]）、動物檢疫、疫苗效力檢測等方面，成為應用最廣泛的檢測方法之一。

隨著自動化檢測技術的發展，全自動酶免工作站開始被熟知和使用，我國引入自動化酶免工作站的歷史可以追溯到上世紀90年代末期[6]。本文所使用工作站為瑞士帝肯（Tecan）制造，該公司全自動酶免工作站自20世紀初被引入[7-9]，至今用途廣泛，涉及獸醫衛生領域[10]、臨床疾病篩查[11]、血液樣本分析[12]等。該工作站目前在國內用戶較多，在多領域進行廣泛使用[13-15]，它可以根據用戶的實驗需求進行配置，同時滿足高通量和靈活性的要求。

本文所采用“雙抗體夾心法”是酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的一種，是指將能夠與抗原特異性結合的抗體與固相載體結合后，再與抗原反應，然后與辣根過氧化物酶HRP標記物結合，形成夾心。最后加入TMB底物顯色，顏色的深淺和樣品中的待測抗原呈正相關。雙抗體夾心法測定抗原含量，特別是當抗原含量較低需要二次放大信號的情況下，操作步驟多、過程繁瑣、耗時較長。本文中所測定的抗原樣本就是此類情況。一般情況下，技術熟練的實驗員每天可完成1-2塊酶標板，即10-20批次的實驗任務，耗時較長，效率較低。本文以全自動酶免工作站為依托設計了全自動化的檢測方法，實現了除解吸附步驟以外的實驗全過程的自動化操作。在此基礎上，通過人機比對實驗確認了全自動方法的可行性，并考察了諸多影響因素，最終建立了一種準確、高效，精密度良好的全自動檢測方法以替代手工操作，極大地提高了實驗效率，避免了手工操作的人員差異，更好地實現了雙抗體夾心法的標準化操作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原樣本：滅活疫苗。

1.1.2 標準品及主要試劑 全滅活疫苗抗原含量檢測試劑盒（ELISA）（疫苗生產企業提供），具體包括96孔酶聯反應板、檢測抗體工作液、酶標抗體工作液、20倍洗滌液、顯色液A、顯色液B、終止液、解吸附劑、參考品。

1.1.3 儀器設備 Freedom EVO-2 150全自動酶免工作站（包括操作平臺，Hydrospeed洗板機和Sunrise酶標儀）（瑞士Tecan公司）；50TS8洗板機（美國BioTek公司）；Varioskan? LUX酶標儀（美國ThermoFisher公司）。

1.1.4 Freedom EVO-2 150全自動酶免工作站主要參數和布局圖主機平臺詳見圖1。

圖1 Freedom EVO-2 150全自動酶免工作站臺面布局圖。注：工作站臺面包括3×3個槍頭位；4個儲板位；2×6個孵育位；6個試劑位；3個加樣板位；洗板模塊；讀數模塊；2組微孔板堆棧

1.2 方法

1.2.1 試劑和樣本準備 實驗開始前，所有滅活疫苗樣本恢復至室溫，取樣前輕柔震蕩予以混勻。準備好試劑盒，取出參考品恢復至室溫，并將濃縮洗板液用純水進行20倍稀釋，配置成工作濃度的洗板液。

1.2.2 待測樣本的解吸附及稀釋 取參考品和抗原樣品各400μl，分別與400μl生理鹽水混合，加入800μl的解吸附劑混勻，放置在室溫25℃條件下反應1小時，其間每隔20分鐘輕柔震蕩混勻。

將解吸附后的參考品及樣品用生理鹽水再進行1倍、2倍、4倍、8倍稀釋。稀釋步驟分別由全自動酶免工作站完成和實驗員手工操作完成。

1.2.3 雙抗體夾心法手工操作規程 將稀釋后的4個濃度梯度的參考品與樣品分別加入酶標板中，每孔100μl，平行2孔，陰性對照（生理鹽水）平行8孔，輕柔震蕩混勻后，將酶標板用封板膜封好后放入潔凈密封袋中，置于37℃恒溫水浴箱中孵育120分鐘。

在中職教育以及旅游業快速發展的過程中，中職旅游專業教育也進一步擴張。當前，中職旅游管理專業已經慢慢發展成為較為成熟的發展體系，不過在教學過程中并沒有徹底擺脫傳統的灌輸式教學模式，這樣就導致培養的人才不能滿足社會發展需要。因此，旅游業重點關注的問題是各院校如何培養適應社會需要的旅游管理專業人才。通過實踐調查研究發現，我國當前在旅游管理專業人才培養以及教育改革方面的研究比較少，特別是在“互聯網+”時代，更應該加強此方面的探索。

取出酶標板，用洗板機清洗5次后拍干。用多道移液器將檢測抗體工作液加入酶標板中，每孔100μl，37℃恒溫水浴箱中孵育30分鐘。再次取出酶標板，清洗5次后拍干，加入酶標抗體工作液，每孔100μl，37℃恒溫水浴箱中孵育30分鐘。取出酶標板，清洗5次后拍干，加入顯色A液，每孔50μl，再加入顯色B液，每孔50μl，輕柔震蕩混勻后，37℃恒溫水浴箱中孵育15分鐘。

取出酶標板，用多道移液器將終止液加入酶標板中，每孔50μl。酶標儀于450/630nm雙波長下讀數，測定每孔OD值。

1.2.4 雙抗體夾心法全自動酶免工作站操作規程 全自動酶免工作站操作規程的建立首先是對工作站主機平臺布局的設計，在有限的空間內，需要實現多個步驟多種試劑多份耗材及多塊酶標板的協同處理。該過程需要考慮諸多因素，如機械臂和加樣通道的資源利用率，槍頭位點的利用率及廢棄槍頭的處理等，因此，經過2個多月的數輪調試及硬件升級，最終實現了硬件完備，布局完善，流程設計高效。

首先，按照試劑盒操作規程結合工作站硬件結構進行編程，具體涉及步驟包括：四級稀釋、孵育、洗板、加液、讀數。各步驟之間的移板操作主要由機械臂（ROMA）完成，加液由96通道機械臂完成。其中四級稀釋的編程較為復雜，除考慮兩組樣品的平行外，還需在盡量短的時間內完成稀釋及上樣操作。針對于多板測試的情況下，各板“四級稀釋”需依次順序進行，所以還需考慮期間的延時等待及后續步驟之間資源占用沖突等問題，最后，經過數十次的調試及測試，實現了六塊酶標板（60批樣品）同時進行“雙抗體夾心法”測定體外效力。具體實驗步驟流程詳見圖2。

圖2 A：單板實驗進程圖（色帶說明詳見備注），B：六板實驗進程圖（色帶說明詳見備注）

全自動操作實驗過程中，實驗員按照提示運行相應程序直至檢測完成即可。

1.2.5 數據處理 采用Statistic Analysis統計軟件分析參考品與樣品結果，選擇連續3-4個稀釋倍數的對數作為橫坐標，OD值平均值的對數作為縱坐標，進行線性分析。計算樣品體外相對效力。

2 驗證實驗和結果

2.1.1“雙抗體夾心法測定樣品體外相對效力”人機比對單板實驗 按照上述方法，實驗員和TECAN全自動酶免工作站分別對相同批號的5批次疫苗樣本進行“雙抗體夾心法”測定體外相對效力實驗，對兩種實驗方式檢測結果進行了比對分析，以確認TECAN全自動酶免工作站可替代手工操作進行“雙抗體夾心法”的體外相對效力實驗并給出可信結果，兩份實驗數據相對偏差應不大于15%[16]。

2.1.2 “雙抗體夾心法測定樣品體外相對效力”人機比對多板實驗 同時測試多塊酶標板的情況下，全自動酶免工作站需依次按順序對每一塊酶標板進行稀釋，這一過程會導致最后一塊酶標板的解吸附時間較第一塊酶標板有所延長，為排除這段時間差可能導致的結果誤差，設計了多板實驗的比對。在全自動酶免工作站同時進行六塊酶標板實驗的同時，實驗員手工進行第六塊酶標板的平行實驗，比對結果偏差。

2.1.3 “雙抗體夾心法測定樣品體外相對效力”避光情況考察顯色液AB液為辣根過氧化物酶HRP的反應底物，暴露在光源下會發生變色，手工操作時需避光實驗，即時加樣；如進行全自動操作程序設計，實現即時加樣需要中斷程序，手工操作。為了全面實現自動化操作，考察了提前放置顯色液AB情況下光照導致的變色是否對實驗結果造成影響。分別設計“即時加樣”和“提前放置”兩種加顯色液的方式，以確認實驗結果是否存在偏差。

2.1.4 “雙抗體夾心法測定樣品體外相對效力”回收試劑考察酶聯免疫法實驗中使用的試劑一般有關鍵試劑和非關鍵試劑[16]，本試驗中所考察的回收試劑屬于關鍵試劑，包括抗體溶液、顯色液等，其成分或穩定性有細小變化即會影響實驗結果。同時抗體制備困難，供應緊張且成本較高，采用全自動酶免工作站實驗各類試劑均不可避免地存在檢測死體積，通過優化試劑盒的尺寸，已將死體積從30ml調整為10ml，為了進一步降低實驗成本，節約試劑，考察了回收試劑進行二次使用對結果的影響。

2.1.5 全自動酶免工作站儀器精密度和方法精密度考察 采用全自動酶免工作站六板程序對9批樣品進行了平行6次測定，分別對6次測定檢測結果的原倍濃度的OD值和檢測所得體外相對效力進行了比對，以確認工作站的操作精密度和方法精密度。

2.2 結果

2.2.1 “雙抗體夾心法測定樣品體外相對效力”人機比對單板實驗結果詳見表1，從表1可以看出5批樣品的人機比對結果的相對偏差均小于15%，符合要求。

表1 人機比對單板實驗結果

2.2.2 “雙抗體夾心法測定樣品體外相對效力”人機比對多板實驗詳見表2，從表2可以看出5批樣品設置到全自動酶免工作站第六塊板進行檢測與手工操作檢測結果的相對偏差均小于15%，符合要求。

表2 人機比對多板實驗結果

2.2.3 “雙抗體夾心法測定樣品體外相對效力”避光情況考察結果詳見表3，從表3可以看出，5批樣品在顯色液A和顯色液B的即時加樣和提前放置的檢測結果的相對偏差均小于15%，符合要求，表明采用全自動酶免工作站進行60批樣品檢測時，可以提前放置顯色液，不需中斷程序，進行即時加樣，更好地實現了全自動化操作。

表3 A/B液變色影響考察結果

2.2.4 “雙抗體夾心法測定樣品體外相對效力”回收試劑考察結果詳見表4，從表4可以看出5批樣品采用新鮮試劑和回收試劑的檢測結果相對偏差均小15%，符合要求，表明使用回收試劑進行樣品檢測對結果的影響符合規定。采用回收試劑進行檢驗可以降低檢驗成本，節約檢驗資源，對于后續大批量檢驗具有重要意義。同時對回收試劑的存放期限進行了進一步的考察，結果表明首次試劑回收后于4℃冰箱保存1周，進行第二次實驗，對實驗結果基本無影響。后續筆者又進行了試劑第二次回收的考察，數據顯示1個月內，多次重復回收的試劑均可正常使用。

表4 回收試劑考察結果

2.2.5 全自動酶免工作站儀器精密度和方法精密度考察結果詳見表5和表6，從表5可以看出，9批樣品采用六板程序平行檢測6次的原倍濃度的檢測OD值的變異系數符合《中國藥典》2020年版四部《9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則》[16]中批內變異系數不超過15%的要求，該結果表明全自動酶免工作站在樣品的稀釋操作，加樣操作，洗板操作及酶標儀檢測的精密度均符合要求。

表5 儀器操作精密度考察結果

表6 自動化方法精密度考察結果

表6為9批樣品平行檢測6次的體外相對效力結果，該結果的變異系數也符合以上指導原則的要求，該結果表明采用全自動酶免工作站進行體外相對效力檢測的方法精密度符合規定，可以很好地替代手工操作，減少人工操作的偏差。

3 討論

3.1 雙抗體夾心法為半定量的檢測方法，操作步驟多，不同人員操作對結果影響因素較大，通過采用多類型實驗驗證，采用全自動酶免工作站和手工操作檢測結果偏差符合要求，結果平行性良好，可替代手工操作。

3.2 六板結果比對表明，第六塊酶標板的四級稀釋較第一塊有50分鐘左右的延遲，但對檢測結果基本無影響。

3.3 回收試劑考察結果表明，提前放置顯色液A/B變色后，不影響效力檢測結果。后續按照提前放置顯色液A/B的方法進行了近百批樣品的檢測，結果均正常。

3.4 精密度考察結果表明采用全自動酶免工作站在大批量樣品檢測中具有平行性良好、結果準確度高的優勢。

3.5 為了后續擴展將解吸附操作實現自動化，本文對室溫下疫苗的穩定性進行了初步考察，結果表明在室溫24小時內，疫苗的體外相對效力結果穩定，為后續大批量樣品的解吸附自動化操作提供了數據支撐。

當前新冠疫情仍在全球肆虐，變異毒株的不斷出現更加大了防疫防控的難度，疫苗作為有效遏制疫情蔓延的最有利的武器，國內及國際的需求量急劇增加。為了全力配合疫情防控的要求，國內疫苗生產企業均進行了全面的擴產，必然導致原液、半成品和成品的效力檢驗任務的大幅度增加，對生產企業和批簽發機構均提出了巨大的挑戰。酶聯免疫法作為當前測定疫苗效力指標的主要方法，開發全自動酶免工作站替代手工操作具有重要的意義，實現了多個步驟的標準化操作，減少了人工操作的偏差，對于提升檢驗效率、保障疫苗供應具有積極的作用，希望以上研究內容為開發全自動酶免工作站進行多種疫苗的效力檢測提供有效的借鑒作用。