用皮質酮替代飲水小鼠模型評價鹽酸羥哌吡酮的抗抑郁效應及機制

房鑫鑫，麻慧，鮑金豪，王川，李云峰，張黎明，聶晶

（1.遵義醫科大學基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州遵義 563099；軍事科學院軍事醫學研究院 2.軍事認知與腦科學研究所，3.毒物藥物研究所，北京 100850；4.河北北方學院研究生院，河北張家口 075000）

隨著現代社會競爭的日益激烈，抑郁癥等情感性疾病的發病率逐年升高，據WHO 調查，預計到2030 年，抑郁癥將成為疾病總負擔排名首位［1］。因抑郁癥具有高發病、高自殺、高復發、高致殘率和低識別、低就診、低治療率等特點，目前已成為全球性嚴重的公共衛生問題和突出的社會問題［1］。目前一線抗抑郁藥是基于20 世紀60 年代“經典單胺理論（策略）”研發，普遍存在起效時間延遲（2～6周）、有效率不高（50%～70%）、缺乏認知改善作用甚至損害認知、導致性功能障礙及自殺傾向等明顯缺陷，因此發展起效快、副作用低的新型抗抑郁藥是目前全球性重大需求和熱點。

應激可導致下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）功能亢進，繼而引起皮質酮（corticosterone，CORT）水平持續升高，是抑郁癥患者常見的生物學異常指標［2］，同時可能也是抑郁癥的重要發病機制之一［3］。既往研究證實，長期sc 給予CORT 可導致顯著的抑郁樣行為［4］，但給藥途徑繁瑣，脂溶性介質引起局部刺激癥狀顯著，且sc 注射的抓取應激對動物行為學結果存在影響，這些缺陷限制了該模型的廣泛使用。

本研究在長期sc 給予CORT 致抑郁模型的基礎上進行優化，所采用的CORT 半琥珀酸酯（CORT hemisuccinate，CORTH）易溶于水，操作簡單。文獻報道，氯胺酮可以逆轉CORT 替代飲水對小鼠懸尾實驗（tail suspension test，TST）中不動時間的增加、蔗糖偏嗜度的降低、高架十字迷宮開放臂進入次數的減少等行為學指標的影響，表現出顯著的抗抑郁、抗焦慮樣效應，再次驗證了該模型的預測有效性［5-6］。

鹽酸羥哌吡酮（hypidone hydrochloride，代號：YL-0919）是全新結構的小分子化合物，在多種動物模型上均具有抗抑郁、抗焦慮和促認知效應［7-11］。本研究擬利用改良的CORT 替代飲水致抑郁樣模型進一步評價和探討其抗抑郁效應及可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

YL-0919（批號：D5222-16-1202，純度99.9%），軍事醫學研究院毒物藥物研究所；鹽酸氟西汀（fluoxetine hydrochloride，Flx，批號：F2008083，純度＞98%），上海阿拉丁生化科技有限公司；CORTH（B2599），美國Steraloids 公司；兔抗小鼠突觸后致密蛋白（PSD95）單克隆抗體、兔抗小鼠雙皮質素（doublecortin，DCX）多克隆抗體和紅色熒光標記山羊抗兔IgG 抗體，美國CST 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體，北京中杉金橋公司。電子分析天平,德國賽托利斯公司；小鼠曠場實驗裝置、懸尾與強迫游泳實驗裝置，深圳瑞沃德生命科技有限公司；熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；凝膠電泳相關器材，美國伯樂公司。

1.2 實驗動物

8周齡雄性C57BL/6小鼠，SPF級，購于北京斯貝福生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010；小鼠每籠5 只飼養，自由進食飲水，飼養溫度20～24℃，濕度40%～60%，12 h黑暗/白晝交替照明（光照時間8∶00～20∶00），適應性飼養14 d后開始實驗。動物實驗及相關操作獲軍事醫學研究院實驗動物倫理委員會批準。

1.3 皮質酮替代飲水小鼠模型的制備

小鼠分為正常對照組和CORT 替代飲水組，實驗方案如圖1所示。正常對照組小鼠給予正常飲用水，CORT替代飲水組小鼠給予CORTH 25 mg·L-1水溶液。每天同一時間更換新鮮配置的CORTH 溶液，并記錄小鼠飲水量［12］。

CORT 替代飲水21 d 后，利用蔗糖偏好實驗（sucrose preference test，SPT）驗證CORT 替代飲水小鼠模型造模效果，隨后將CORT 替代飲水組小鼠隨機分為模型組（ig 給予同體積雙蒸水）、模型+Flx（10 mg·kg-1，ig）組和模型+YL-0919（1.25，2.5和5 mg·kg-1，ig）組。

1.4 行為學測試

1.4.1 蔗糖偏好實驗

分別于給藥前和給藥第14 天進行SPT。實驗開始前進行糖水訓練：首先給予小鼠2瓶飲用水，使其自由飲用，適應24 h 后，更換為2 瓶1%蔗糖溶液，再適應24 h。適應結束后，進行小鼠SPT 測試：小鼠禁水16 h（在此期間不限制攝食），之后給予小鼠飲用水和1%蔗糖溶液各1 瓶，稱重記錄2 h 內小鼠對飲用水及蔗糖溶液的消耗質量。蔗糖偏嗜度=蔗糖溶液消耗質量/（飲用水消耗質量+蔗糖溶液消耗質量）［13］。

1.4.2 曠場實驗（open field test，OFT）

連續給藥第7 天進行OFT［14］。將小鼠面向實驗箱壁放入實驗箱（41 cm×41 cm×41 cm，底部均分為16 小格，其上方45 cm 處放置一60 W 燈泡照明），自由活動5 min。采用SMART視頻分析軟件對小鼠運動距離進行分析，以反映小鼠自發活動，同時對小鼠進入中心區累計停留時間進行統計。

1.4.3 小鼠強迫游泳實驗（forced swimming test，FST）

連續給藥第8 天進行FST［15］。將小鼠置透明玻璃缸（直徑15 cm，高22 cm）中，水溫24℃，水深16 cm，每只小鼠游泳6 min，統計后4 min 小鼠累計不動時間。各玻璃缸間均用黑色不透明塑料板遮擋，避免動物相互間視覺干擾。

1.4.4 小鼠懸尾實驗

連續給藥第9天進行TST［16］。在距離小鼠尾尖約1.5 cm 處，使用膠帶將鼠尾固定并懸掛在距離地面50 cm 的懸尾箱中，測試持續6 min，統計后4 min小鼠累計不動時間。

1.4.5 新物體識別實驗（novel object recognition test，NORT）

連續給藥第11 天進行NORT［17］。實驗前2 d 進行適應性訓練，在曠場箱內對稱位置，放置2 個完全相同的物體，將小鼠按照OFT 放置位置放入箱內進行5 min 自由探索。第2 天進行NORT，將箱內其中1 個舊物體更換為1 個全新物體（顏色、形狀、材質均與舊物體不同，但大小與舊物體相似），將小鼠按之前位置放入箱內，自由探索5 min。分別統計小鼠探索新、舊物體的累計時間，計算識別指數。識別指數=新物體探索時間/（新物體探索時間+舊物體探索時間）。

1.4.6 新奇抑制攝食實驗（novelty suspended feeding test，NSFT）

連續給藥第12天進行小鼠NSFT［17］。小鼠更換墊料并禁食16 h（飲水不限），測試開始前將小鼠置全新安靜環境中適應30 min（與小鼠飼養環境及其他測試環境均不同）。在41 cm×51 cm×21 cm 測試箱內鋪設約1 cm厚干凈墊料，在測試箱內中間位置放置5 粒食丸。測試時將小鼠面向箱壁放入，記錄小鼠5 min內第1次攝食的潛伏期。

1.5 免疫熒光檢測小鼠海馬齒狀回DCX陽性細胞數

小鼠行為學檢測后，用1% 戊巴比妥鈉（50 mL·kg-1，ip）將小鼠麻醉，從左心室經升主動脈先后灌入50 mL 預熱（35～37℃）0.9%生理鹽水和50 mL 預冷（4℃）4%多聚甲醛溶液。隨后取腦，置4%多聚甲醛溶液中，4℃后固定24 h；分別置4℃20%和30%蔗糖溶液中浸泡脫水，用OCT 包埋固定，用冰凍切片機切片，厚度為30 μm，貼片后凍存于-20℃備用。

實驗當天，在12 孔板內加入適量PBS（0.01 mmol·L-1），將腦片放入其中，室溫振搖漂洗3 次，每次5 min。吸去PBS，加入適量封閉緩沖液，室溫輕搖1.5 h。腦片孵育板中每孔加入120 μL 抗DCX 抗體孵育液（1∶800），隨后置入腦片，4℃孵育過夜；漂洗3次后加入120 μL二抗孵育液（1∶2000），室溫輕搖1.5 h，再次漂洗后封片。使用倒置熒光顯微鏡觀察拍照，使用Image J 軟件分析統計海馬齒狀回DCX陽性細胞數。

1.6 Western 印跡法檢測小鼠海馬PSD95 蛋白表達水平

小鼠行為學檢測后斷頭取腦并分離海馬，置-80℃保存。雙側海馬組織加入100 μL冰凍的組織勻漿液，超聲研磨器研磨2～3 次，至無肉眼可見塊狀沉淀，4℃靜置30 min 后4℃12 000×g離心10 min，取上清，隨后進行蛋白定量及分裝。采用10%預制膠進行SDS-PAGE 電泳并恒壓轉印至PVDF 膜。將PVDF 膜置封閉緩沖液中室溫下搖床輕搖1 h；加入一抗（抗PSD95：1∶1000；抗β肌動蛋白：1∶2000），4℃搖床孵育過夜；將PVDF 膜置TBST 中振搖漂洗3 次；之后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 室溫孵育1.5 h；再將PVDF 膜置TBST 中振搖漂洗3 次，每次10 min。用化學發光成像分析儀顯示蛋白條帶；將超敏發光A、B 液按1∶1 比例混合，均勻滴于PVDF 膜上，1 min 后將PVDF 膜轉移至凝膠成像系統中曝光成像；用Image J 軟件分析蛋白條帶積分吸光度值。以目標蛋白與內參蛋白積分吸光度值的比值反映目標蛋白相對表達水平。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 CORT替代飲水小鼠抑郁樣模型的鑒定

CORT 替代飲水21 d，小鼠SPT 結果如圖2 所示。與正常對照組相比，模型組小鼠蔗糖偏嗜度顯著下降（P＜0.01），表現出快感缺失，提示模型組小鼠出現抑郁樣行為，CORT 替代飲水小鼠抑郁樣模型制備成功。

2.2 YL-0919 對CORT 替代飲水模型小鼠自發活動的影響

YL-0919 連續給藥第7 天進行OFT，結果如圖3 所示。各組小鼠運動距離均無顯著差異，提示CORT 替代飲水模型小鼠自發活動無明顯變化，模型+Flx 組和模型+YL-0919 組小鼠自發活動亦無顯著變化。

2.3 YL-0919 對CORT 替代飲水模型小鼠抑郁樣行為的影響

YL-0919 連續給藥第8 和9 天分別進行FST 和TST，結果如圖4A和4B所示。與正常對照組相比，模型組小鼠強迫游泳不動時間和懸尾不動時間顯著增加（P＜0.01），提示CORT 替代飲水模型小鼠出現抑郁樣行為；與模型組相比，模型+YL-0919 1.25，2.5 和5 mg·kg-1組和模型+Flx 組小鼠強迫游泳和懸尾不動時間顯著減少（P＜0.01）。

YL-0919 連續給藥后第12 天進行NSFT，結果如圖5A 所示。與正常對照組相比，模型組小鼠攝食潛伏期明顯延長（P＜0.01）；與模型組相比，模型+YL-0919各劑量組和模型+Flx組小鼠攝食潛伏期均明顯縮短（P＜0.01）。

YL-0919連續給藥后第14天進行SPT，結果如圖5B 所示。與正常對照組相比，模型組小鼠蔗糖偏嗜度顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+YL-0919各劑組組與模型+Flx組小鼠蔗糖偏嗜度均明顯升高（P＜0.01）。

以上結果提示，YL-0919 可顯著逆轉CORT 替代飲水誘發的抑郁樣行為，具有抗抑郁效應。

2.4 YL-0919 對CORT 替代飲水模型小鼠焦慮樣行為的影響

YL-0919 連續給藥后第7 天進行OFT，結果如圖6 所示。與正常對照組相比，模型組小鼠在曠場中心區累計停留時間明顯減少（P＜0.01），提示CORT 替代飲水模型小鼠出現焦慮樣行為；與模型組相比，模型+YL-0919 2.5 mg·kg-1組在曠場中心區累計停留時間明顯延長（P＜0.01），提示YL-0919可緩解CORT替代飲水模型小鼠的焦慮樣行為。

2.5 YL-0919 對CORT 替代飲水模型小鼠認知障礙的影響

YL-0919 連續給藥后第10 天進行NORT，結果如圖7 所示。與正常對照組相比，模型組小鼠識別指數顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+YL-0919 5 mg·kg-1組小鼠識別指數顯著升高（P＜0.05），提示YL-0919 可改善CORT 替代飲水模型小鼠的認知障礙。

2.6 YL-0919 對CORT 替代飲水模型小鼠海馬齒狀回DCX陽性細胞數和PSD95蛋白表達的影響

如圖8所示，與正常對照組相比，模型組小鼠雙側海馬齒狀回DCX陽性細胞數顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，模型+YL-0919 2.5 和5 mg·kg-1組及模型+Flx 組DCX 陽性細胞數顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。Western 印跡檢測結果（圖9）顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠海馬PSD95蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；模型+YL-0919 1.25，2.5 和5 mg·kg-1組及模型+Flx組PSD95蛋白表達水平顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

本研究利用優化的CORT 替代飲水小鼠模型評價YL-0919的抗抑郁效應。結果顯示，慢性給予YL-0919 1.25～5 mg·kg-1可明顯改善CORT 替代飲水模型小鼠抑郁樣和焦慮樣行為及認知障礙。進一步機制研究顯示，YL-0919 可增加CORT 替代飲水模型小鼠海馬齒狀回DCX 陽性細胞數和海馬PSD95蛋白表達水平，提示YL-0919可能通過改善神經可塑性發揮抗抑郁效應。

FST 和TST 是公認的用于抗抑郁藥物評價的實驗方法，SPT 可評價抑郁癥的核心癥狀——快感缺失，NSFT 也可廣泛應用于抗抑郁藥物篩選。本研究在CORT 替代飲水小鼠模型制備成功后，通過上述實驗進行行為學評價。結果發現，用CORTH溶液替代正常飲水可誘發持續性抑郁樣行為，其行為表現為蔗糖偏嗜度降低及FST 和TST 的不動時間增加，與sc 給予CORT 的行為學變化一致［21-22］。本課題組前期在小鼠NSFT［7，18］、小鼠獲得性無助［18］和大鼠慢性不可預知應激［10-19］等抑郁樣動物模型上發現，ig 給予YL-0919（1.25～5 mg·kg-1）具有顯著的抗抑郁作用。因此，本研究選擇同樣的劑量評價YL-0919 的抗抑郁作用。研究結果顯示，在CORT 替代飲水模型上，慢性給予YL-0919 可顯著逆轉上述行為表征，進一步證實了YL-0919 的抗抑郁效應。

生理狀態下，嚙齒類動物腎上腺分泌的CORT直接進入全身血液循環，而外源性補充的CORT（包括飲水或sc給予等）需要通過肝代謝，因此兩者對HPA軸的調控作用方式不完全一致。但長期sc、iv 或植入滲透性微型泵等方式操作難度大，易對動物造成創傷或應激［20］。綜合考慮上述因素，本研究最終采用CORT 替代飲水模型。正常C57BL/6 小鼠體內CORT的基線水平約為50 μg·L-1［21-22］。在本研究條件下，經檢測小鼠飲用CORTH 25 mg·L-1溶液第21 天血液中CORT 濃度在280～340 μg·L-1，這與既往利用慢性社交失敗應激構建的小鼠抑郁樣模型中血漿CORT 水平（300 μg·L-1）相吻合［21］。本研究采用SPT 檢測發現，小鼠CORTH 替代飲水第21天后能誘發抑郁樣行為，證實該模型穩定可靠。

本研究YL-0919 部分焦慮樣行為實驗（NFST和OFT）中，其行為檢測結果未表現出典型的劑量依賴關系，這與本實驗室以往研究結果一致［7，9-10］。同時，該結果與部分5-羥色胺重攝取抑制類抗抑郁藥物在Lancet Psychiatry的薈萃分析結果類似［23］。

神經可塑性是指神經結構和功能的可修飾性，包括突觸可塑性、神經元再生、神經網絡重新整合和大腦功能區轉移等。臨床研究表明，抑郁癥患者海馬體積減小，且減小程度與病程長短、治療時間以及病情嚴重程度有關［24-26］。動物實驗也發現，慢性應激可導致海馬神經元樹突復雜度降低、樹突棘密度減小［27］，以及海馬齒狀回神經元新生減少［28］。同時，神經營養因子和5-HT 重攝取抑制劑Flx 均被證明可通過促進海馬神經元新生發揮抗抑郁作用［29-30］。DCX 是一種神經元特異性蛋白，在神經元早期有絲分裂過程中促進微管的聚合和穩定。DCX 陽性細胞通常作為神經發生的標志物被廣泛用于檢測神經元新生。本研究發現，YL-0919 可顯著逆轉CORT 替代飲水模型小鼠海馬齒狀回DCX陽性細胞數量降低。PSD95 是興奮性突觸后膜的標志物之一。文獻報道，慢性不可預知性應激會導致小鼠海馬PSD95 表達水平降低，Flx 長期給藥可逆轉這一變化［31］。本研究發現，YL-0919 亦可顯著逆轉CORT 替代飲水模型小鼠海馬PSD95 表達下調。

綜上，本研究采用CORT 替代飲水小鼠模型發現，YL-0919具有顯著的抗抑郁效應，且該效應與提升海馬神經可塑性密切相關。本研究為探索YL-0919的抗抑郁作用機制提供新的實驗依據。