奧貝膽酸聯合白藜蘆醇對小鼠非酒精性脂肪性肝病的治療作用

高川，姚宜山，周奎臣，付海洋，王金柱，梁霞霞，王瑜

（1.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江佳木斯 154007；2.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，北京 100850；3.長治醫學院藥學院，山西長治 046000）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括單純性脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）和肝硬化，嚴重者可發展為肝細胞癌［1］。目前全球25%的人患有NAFLD［2］，并隨生活水平的提高NAFLD患病率持續上升［3-4］。奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA）是一種法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，FXR），能夠調節脂質和葡萄糖代謝的轉錄因子，主要作用是通過抑制編碼膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）的細胞色素P450 基因表達和提高膽汁酸轉運蛋白表達而減少膽汁酸［5］。此外，OCA 可有效降低NAFLD 患者脂肪變性，改善肝組織纖維化［6］，但其低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和總膽固醇（total cholesterol，TC）升高，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）降低，增加心血管疾病風險等問題較為突出［7-8］。白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是一種抗衰老、抗氧化、抗炎和胰島素敏感的天然多酚化合物，對過氧化氫誘導的細胞凋亡有抑制作用［9］，可緩解炎癥刺激、氧化應激及細胞凋亡等產生的肝損傷［10］。另外，可通過調節脂代謝升高HDL、降低LDL 而降低心血管疾病風險［11］，還可降低肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，減少心肌梗死面積而發揮對心肌梗死的治療作用［12］。本研究旨在探索OCA與RSV 聯用對NAFLD 的治療作用及其可能的作用機制，以期為OCA 聯合RSV 治療NAFLD 提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

OCA，純度98%，廈門海樂景生化有限公司；白藜蘆醇，純度98%上海邁瑞爾化學技術有限公司；SOD 和MDA 測試盒，南京建成生物工程研究所；谷丙轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、谷草轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）、甘油三酯（triglycerides，TG）、TC、HDL 和LDL 檢測試劑盒，美國貝克曼庫爾特有限公司；白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒，上海炫雅生物科技有限公司；兔抗小鼠沉默信息調節因子1（sirtuin 1，Sirt1）、NF-κB 和磷酸化NF-κB（p-NF-κB）單克隆抗體（一抗）及IRDye 800CW 熒光標記山羊抗兔IgG 抗體（二抗），美國Cell Signaling Technology 公司；紫外可見分光光度計（型號UV-26001），津島儀器（蘇州）有限公司；全自動生化分析儀（型號AU5800），美國貝克曼庫爾特有限公司；多功能微孔板讀板機（型號Spectra Max i3x），美國Molecular Devices公司。

1.2 動物、NAFLD模型制備和分組

42 只SPF 級雄性C57BL/6N 小鼠〔許可證號：SCXK（京）2016-0006〕，6周齡，體重16～18 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠自由飲水和進食，定期更換墊料，在環境安靜、溫度23～25℃、相對濕度40%～60%和12 h晝夜交替條件下飼養。小鼠隨機分為正常對照組（8 只）和建模組（34 只），建模小鼠每周1 次ip 給予1% 四氯化碳（CCl4）5 mL·kg-1，同時飼喂高脂飼料（由15%豬油、2.8%膽固醇、0.28%甲硫氧嘧啶、0.7%膽酸鈉和81.2%普通飼料組成），持續28 d。隨機選取2 只小鼠，處死后觀察肝體積略增大，包膜緊張光滑，邊緣變鈍，質地柔軟，色黃，有油膩感；切片觀察有大量脂滴視為NAFLD 模型制備成功。將建模小鼠隨機分為模型組、模型+RSV 組、模型+OCA 組和模型+OCA+RSV 組，OCA 和RSV 均30 mg·kg-1（參考文獻［13］），每組8 只；每天ig 給藥1 次，連續給藥28 d；正常對照組和模型組ig 給予等體積0.5%羧甲纖維素鈉混懸液。

1.3 樣本制備

給藥28 d 后，禁食不禁水12 h，次日對各組小鼠稱量體重，處死后取血于1.5 mL 離心管中，制備血清，-20℃冰箱中保存。取肝并稱重，于肝左葉切取2塊5 mm×5 mm×5 mm 肝組織，4%多聚甲醛固定，其余-80℃凍存。

1.4 計算肝指數

據1.3 體重和肝重計算肝指數。肝指數=肝重（g）/體重（g）×100。

1.5 HE染色觀察肝組織病理變化

取1.3 制備的肝組織，經石蠟固定、HE 染色后于200倍鏡下觀察炎癥細胞浸潤、脂肪空泡、纖維化和組織結構的變化。

1.6 油紅O染色觀察肝組織脂質沉積和脂滴面積

取1.3 制備的肝組織，OCT 包埋，冰凍切片，進行油紅O 染色，吸水紙吸干水分后甘油明膠封片。油紅O 染色后脂肪呈紅色，正常肝組織顯示青藍色。于顯微鏡鏡下（×200）觀察肝細胞內脂肪變化，并用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0定量分析脂滴面積。脂滴面積百分比（%）=紅色脂滴覆蓋面積/總測量面積×100%。

1.7 全自動生化儀檢測血清GPT，GOT，TG，TC，HDL和LDL水平

取1.3 制備的血清，用全自動生化儀檢測小鼠血清GPT，GOT，TG，TC，HDL和LDL水平。

1.8 檢測血清SOD活性和MDA含量

取1.3 制備的小鼠血清，按試劑盒說明書檢測血清SOD活性和MDA含量。用紫外分光光度儀分別于550和532 nm波長檢測各孔吸光度值。

1.9 ELlSA檢測血清lL-1β，lL-6和TNF-α含量

取1.3 制備的血清，用ELISA 試劑盒檢測血清IL-1β，IL-6和TNF-α含量。

1.10 Western 印跡法檢測肝組織Sirt1，NF-κB 和p-NF-κB蛋白水平

取1.3 凍存肝組織，各組稱取50～100 mg 提取總蛋白，用BCA 法進行蛋白定量。取等量蛋白，加入等體積上樣緩沖液，混勻后99℃恒溫金屬浴10 min。每孔上樣15 μL，80 V，電泳30 min，再用120 V 電壓電泳100 min。冰浴，200 mA 電流，轉膜100 mim。按1∶500 稀釋一抗，4℃孵育過夜；按1∶5000 稀釋二抗，室溫孵育120 min。以目標蛋白和內參蛋白積分吸光度值比值表示目標蛋白相對表達水平。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯用對NAFLD 模型小鼠肝指數的影響

表1結果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠肝指數明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+OCA 組、模型+RSV 組和模型+OCA+RSV 組小鼠肝指數明顯降低（P＜0.01）。與模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV組肝指數明顯降低（P＜0.05），但與模型+OCA 相比，其肝指數降低不明顯。表明OCA與RSV聯用比RSV單用可更有效降低肝指數。

Tab.1 Effect of obeticholic acid（OCA）combined with resveratrol（RSV）on liver indexes of model mice with non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）

2.2 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯用對NAFLD 模型小鼠肝組織病理變化的影響

HE染色結果如圖1顯示，正常對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞排列整齊，無炎癥細胞浸潤，細胞無脂變。模型組肝小葉界限不清，肝細胞索排列紊亂，出現彌漫性脂肪變性，可見大小不等、數量不一的脂滴空泡。模型+OCA 組和模型+RSV 組肝小葉不清晰，肝細胞形態大致正常且大小較一致，部分肝細胞輕度水樣變性，脂滴空泡減少。模型+OCA+RSV 組肝小葉清晰，肝細胞大小較一致且形態正常，脂滴空泡減少，脂質沉積程度減輕。

2.3 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯用對NAFLD 模型小鼠肝細胞中脂質沉積的影響

如圖2A 所示，正常對照組小鼠肝細胞幾乎無紅染，無脂變。模型組小鼠肝細胞內脂滴被染成紅色，大小不一，廣泛分布在胞質中，提示大量肝細胞內存在脂質沉積。模型+OCA 組和模型+RSV 組小鼠肝細胞內紅色脂滴減少，脂質沉積程度有所減輕。模型+OCA+RSV 組肝細胞內紅色脂滴減少，脂質沉積程度減輕。如圖2B 所示，與正常對照組相比，模型組脂滴面積百分比明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+OCA 組、模型+RSV 組和模型+OCA+RSV 組脂滴面積百分比明顯降低（P＜0.01）。與模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV組脂滴面積百分比明顯減低（P＜0.01）。

2.4 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯用對NAFLD 模型小鼠肝功能和血脂的影響

由表2 可知，與正常對照組相比，模型組血清GPT，GOT，TG，TC 和LDL 水平明顯升高，HDL 水平明顯降低（P＜0.01），提示模型小鼠發生肝損傷和血脂紊亂。與模型組相比，模型+OCA 組血清GPT，HDL 和LDL 水平變化均不明顯，GOT，TG 和TC 水平明顯下降（P＜0.05）；模型+RSV 組血清GPT，GOT和HDL水平變化不明顯，TG，TC和LDL水平明顯下降（P＜0.01）；模型+OCA+RSV 組血清GPT，GOT，TG，TC 和LDL 水平均明顯下降（P＜0.01），HDL 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型+OCA 組相比，模型+OCA+RSV 組GPT，TC 和LDL水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV組GPT和GOT水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL水平明顯升高（P＜0.05）。

2.5 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯用對NAFLD 模型小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

由表3可知，與正常對照組相比，模型組小鼠血清SOD 活性明顯降低，MDA 含量明顯升高（P＜0.01），提示模型小鼠肝組織發生氧化應激。與模型組相比，模型+OCA 組SOD 活性明顯升高（P＜0.01），MDA 含量下降（P＜0.05）；模型+RSV 組SOD 活性明顯升高（P＜0.01）；模型+OCA+RSV 組SOD 活性明顯升高，MDA 含量明顯下降（P＜0.01）。與模型+OCA 組和模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV 組SOD 活性變化不明顯，但MDA 含量明顯降低（P＜0.01）。表明兩者聯合用藥比兩者單用具有更好的抗氧化應激作用。

Tab.2 Effect of OCA combined with RSV on levels of serum glutamic pyruvic transaminase（GPT）, glutamic oxaloacetic transaminase（GOT）, triglyceride（TG），total cholesterol（TC），high-density lipoprotein（HDL）and lowdensity lipoprotein（LDL）of model mice with NAFLD

Tab.3 Effects of OCA combined with RSV on serum superoxide dismutase (SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content of model mice with NAFLD

2.6 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯用對NAFLD模型小鼠血清lL-1β，lL-6和TNF-α水平的影響

由表4可知，與正常對照組相比，模型組小鼠血清IL-1β，IL-6 和TNF-α 水平明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，模型+OCA 組IL-1β 水平變化不顯著，IL-6和TNF-α水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；模型+RSV 組IL-1β，IL-6 和TNF-α 水平明顯降低（P＜0.01）；模型+OCA+RSV組IL-1β，IL-6和TNF-α水平均明顯降低（P＜0.01）。與模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV 組IL-6 水平明顯降低（P＜0.01）。與模型+OCA 組相比，模型+OCA+RSV 組IL-1β 和IL-6明顯降低（P＜0.01）。

Tab.4 Effect of OCA combined with RSV on serum interleukin-1β（lL-1β），lL-6 and tumor necrosis factor-α（TNF-α）levels of model mice with NAFLD

2.7 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯用對NAFLD模型小鼠肝組織Sirt1，NF-κB和p-NF-κB蛋白表達水平的影響

由圖3可知，與正常對照組相比，模型組肝組織Sirt1 蛋白表達水平明顯降低，NF-κB 和p-NF-κB 表達水平明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，模型+OCA組Sirt1，NF-κB和p-NF-κB蛋白表達水平無明顯變化；模型+RSV 組Sirt1 蛋白表達水平明顯增加（P＜0.01），NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；模型+OCA+RSV 組Sirt1 蛋白表達水平明顯增加（P＜0.01），NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），且p-NF-κB 蛋白表達水平較模型+OCA組明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

本研究結果表明，OCA 與RSV 聯用可降低NAFLD 模型小鼠血清MDA 水平，同時Sirt1 蛋白表達水平升高，NF-κB 表達水平降低，IL-6，IL-1β 和TNF-α 分泌降低。有研究表明，細胞內抗氧化劑的消耗和炎癥反應在NAFLD 形成中具有重要作用，是對肝“二次打擊”的主要形式，隨后肝細胞死亡和細胞凋亡，促使NAFLD 向NASH 進展［14］，過氧化產物MDA 含量可體現細胞受氧自由基損傷程度［15］。NF-κB是至關重要的核轉錄因子，促進炎癥因子IL-6，IL-1β 和TNF-α 分泌［16］。高脂飲食可激活NF-κB，升高肝組織IL-6，IL-1β 和TNF-α 水平［17］。Sirt1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性酶［18］，Sirt1 可使NF-κB 亞基去乙酰化，并抑制其轉錄活性［19］，減少炎癥因子分泌，抑制炎癥對NAFLD 的肝損傷，而阻止從NAFLD 進展為NASH。本研究結果表明，OCA 與RSV 聯用清除體內MDA 能力增加，減輕肝脂質過氧化，提高抗氧化能力，同時增加Sirt1 表達并抑制NF-κB 激活，提示OCA 與RSV 聯用可能通過Sirt1/NF-κB 途徑減少IL-6，IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子分泌，降低NAFLD 氧化應激對肝“二次打擊”和炎癥因子對肝的損傷。

本研究結果表明，OCA 與RSV 聯用在改善NAFLD 組織和血清指標的同時，可更顯著降低TC和LDL 水平，升高HDL 水平，與前期相關研究結果［20］一致。有研究表明，OCA 在降低NAFLD 患者肝脂肪水平時，血清LDL 和TC 升高，HDL 降低，從而使心血管疾病風險增加［8］。TC 增加會導致動脈硬化，誘發心血管疾病，可作為準確預測心血管風險的指標［20-21］，同時HDL降低和LDL升高也是心血管疾病發病的重要因素［22］。本研究結果表明，OCA與RSV 聯用還改善了OCA 在脂蛋白和血脂調節能力的不足，從而降低了OCA 單用時TC 和LDL 升高、HDL降低導致的心腦血管等風險。

綜上所述，OCA 與RSV 聯用可提高抗氧化應激能力，并通過調節Sirt1 和NF-κB 蛋白表達及NF-κB 活化減少炎癥因子分泌，從而減輕NAFLD模型小鼠肝損傷，阻止NAFLD 進一步發展；還可調節血脂和脂蛋白，降低OCA單用帶來的心血管疾病風險。本研究結果為OCA 與RSV 聯用治療NAFLD提供了實驗依據。