兩種檢測尼帕病毒的實時熒光定量PCR方法的比較與效果驗證

肖舒奇，師永霞，夏 菡，危宏平，袁志明，3，黃 弋，3

尼帕病毒(Nipah virus, NiV)是一種高致病性的人獸共患病毒，屬于副黏膜病毒科(Paramyxoviridae)亨尼帕病毒屬(Henipavirus)。該病毒于1998年在馬來西亞的森美蘭州雙溪尼帕新城被首次發現，并于1999年在一家養豬場第1次引發疫情，造成大量生豬死亡。隨后，在孟加拉國、印度、新加坡、柬埔寨等國家出現了多次尼帕病毒引發的疫情，給當地養豬業造成了巨大的影響[1]。尼帕病毒主要的自然宿主是狐蝠科的果蝠，可以感染豬、牛、馬、山羊、貓、狗等多種動物，其中在豬中具有高度傳染性，還可通過動物或者被污染的食物直接傳播給人類，也可以直接人傳人[2-6]。人類感染尼帕病毒后，會出現急性呼吸道感染和致命性腦炎，也會有無癥狀感染者，病死率為40%～75%。在2018年5月的印度喀拉拉邦地區暴發的疫情病死率高達91%[7]。由于該病毒宿主廣泛，發病率和致死率高，目前沒有針對其感染的有效疫苗或藥物[8]，被列為生物危害四級病原(Risk group 4)。

目前，我國沒有出現尼帕病毒感染的病例，但考慮到尼帕病毒的自然宿主果蝠在我國的華南地區和東南部沿海島嶼也有分布，且和人畜的活動范圍有廣泛的重疊，加上周邊國家地區的疫情狀況及頻繁的國際貿易來往，我國廣西、廣東、云南和海南等地存在尼帕病毒流行的風險[9-11]。因此，我國需要建立病毒的分離鑒定、核酸檢測、血清學檢測等多種診斷方法，完善尼帕病毒監測、預警和預報體系，降低尼帕病毒在我國流行的風險，保障人和動物的生命安全，維護社會公共衛生安全。

尼帕病毒是一種不分節段的單股負鏈的RNA病毒， 有囊膜和刺突， 病毒顆粒直徑為40 nm至600 nm。其基因組全長約18.2 kb，編碼6種結構蛋白，分別是核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)[12-14]。NP在病毒基因組的復制、轉錄及病毒組裝發揮重要作用[15]，其基因序列保守，編碼區核苷酸同源性高于其他基因，本研究中比較和驗證的方法均是以NP為目標基因建立的核酸檢測方法。

尼帕病毒是生物危害四級(Risk group 4)病原，此前由于缺乏尼帕病毒來源，核酸檢測方法的驗證通常只能使用質粒、假病毒或者體外轉錄模板RNA作為模擬樣本，而本研究是國內首次利用尼帕病毒樣品對兩種實時熒光定量PCR(TaqMan real-time RT-PCR)檢測方法進行比較和驗證，為實時熒光定量PCR核酸檢測方法的有效性提供了進一步評估驗證，為建立良好、有效和穩定的診斷方法提供了技術支持。

1 材料與方法

表1 兩種尼帕病毒實時熒光定量PCR檢測方法引物、探針序列Tab.1 TaqMan real-time RT-PCR primers and probes

1.2 體外轉錄RNA標準品制備 選取合適的酶切位點，對含有尼帕病毒NP基因的質粒(pGH-NiV-NP，奧科鼎盛(武漢)生物科技有限公司)進行線性化。然后以純化的線性化質粒DNA為模板 (E.Z.N.A.TMCycle-Pure Kit, Omega)，使用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7 (Promega)試劑盒進行體外轉錄[18]。轉錄后用DNase I (1U/μL, Beyotime)消化，并確認無殘留DNA。待DNA完全被消化完之后，使用E.Z.N.A.TMMicroElute RNA Clean-up Kit (Omega)對RNA進行純化處理，最后將得到的RNA標準品分裝保存在-80 ℃冰箱。

1.3 病毒滴度測定 尼帕病毒(Bangladesh)由武漢國家生物安全(四級)實驗室提供。取100 μL病毒進行梯度稀釋(10-1～10-9)，加入前1 d鋪好Vero E6細胞的96孔板，每孔100 μL病毒稀釋液，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱內孵育1 h后，棄上清，每孔加入100 μL新鮮的含2% FBS (Gibco)的DMEM (Gibco)培養基。37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養3～5 d后可觀察細胞病變，記錄結果。

克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)、登革病毒(Dengue virus, DENV)、日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、 云南版納病毒(Banna virus, BAV)、艾比湖病毒(Ebinur Lake Virus, EBIV)、寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、西藏環狀病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)均由國家病毒資源庫提供。使用TRIzol LS(Invitrogen)試劑對上述病毒的細胞感染上清樣本進行滅活并提取相應的病毒RNA作為特異性分析的對照樣品。提取的RNA均保存于-80 ℃冰箱。

1.5 實時熒光定量PCR(TaqMan real-time RT-PCR) 實時熒光定量PCR使用HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit (Vazyme)試劑盒，依據使用說明書配制反應體系。每一個反應體系包含10 μL 2×One Step Q Probe Mix 緩沖液，1 μL One Step Q Probe Enzyme Mix酶混合物，0.4 μL 上游引物 (10 μmol/L)，0.4 μL 下游引物 (10 μmol/L)，0.2 μL TaqMan 探針 (10 μmol/L)，6 μL RNase-free dd H2O和 2 μL RNA，總體積為20 μL。使用實時熒光定量PCR儀(CFX96, Bio-Rad)進行擴增，反應條件：50 ℃ 15 min, 95 ℃ 30 s，然后按95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環，在60 ℃采集熒光信號。

1.6 以體外轉錄RNA為模板的標準曲線建立 將濃度為0.38 ng/μL體外轉錄的RNA標準品按10倍梯度稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)，使用RNase-free dd H2O稀釋，且作為陰性對照，用建立的實時熒光RT-PCR方法的體系和反應條件確定兩種檢測方法的靈敏度，每種濃度的RNA標準品平行做3個復孔，并分別重復檢測3次，繪制以體外轉錄RNA為模板的標準曲線。

1.7 以病毒RNA為模板的特異性和靈敏度分析 使用NiV-NP-Q和NiV-NP-UD兩種實時熒光定量PCR方法同時檢測NiV、DENV、JEV、BAV、EBIV、ZIKV、TIBOV、EBOV、CCHFV病毒的核酸，RNase-free dd H2O作為陰性對照，每種樣品重復3次。此外，使用兩種實時熒光定量PCR方法分別對梯度稀釋的尼帕病毒細胞感染上清樣本(101～107TCID50/mL)進行檢測，以Log TCID50/mL為x軸、Ct值為y軸，繪制以已知滴度病毒RNA為模板的標準曲線。

2 結 果

2.1 標準曲線建立 兩種檢測方法的標準曲線見圖1，以體外轉錄RNA模板拷貝數的對數(log RNA copies)為橫坐標，以Ct值為縱坐標，NiV-NP-Q檢測方法得到的標準曲線方程為y=-3.427 9x+41.631,R2=1，NiV-NP-UD檢測方法的標準曲線方程為y=-3.336 1x+41.246,R2=1，均呈現良好的線性關系，并且兩種方法的檢測靈敏度均為10 copies/μL。圖2為擴增曲線。每種濃度的RNA標準品重復檢測3次，結果一致，變異系數均小于5%，顯示兩種檢測方法都有較好的重復性和穩定性。

2.2 特異性分析 從NiV、DENV、JEV、BAV、EBIV、ZIKV、TIBOV、EBOV和CCHFV病毒感染細胞上清中提取病毒核酸，所得核酸濃度分別為97.9 ng/μL (NiV)、2.5 ng/μL (DENV)、38.1 ng/μL (JEV)、4.0 ng/μL (BAV)、17.4 ng/μL (EBIV)、6.8 ng/μL (ZIKV)、11.5 ng/μL (TIBOV)、17.2 ng/μL (EBOV)和208.8 ng/μL (CCHFV)。用NiV-NP-Q和NiV-NP-UD兩種方法分別對上述病毒核酸進行檢測，結果如圖3所示。由圖可見只有NiV的檢測結果是陽性，其余均為陰性，說明2種方法對以上8種病毒沒有交叉擴增，均具有較好的特異性。

圖1 兩種尼帕病毒實時熒光定量PCR檢測方法靈敏度分析Fig.1 Sensitivity of two TaqMan real-time RT-PCR methods. Standard curves for NiV-NP-Q (a) and NiV-NP-UD (b) were constructed with seven 1∶10 dilutions ranging from 107 copies/μL to 101 copies/μL of in vitro transcribed RNA

圖2 兩種尼帕病毒實時熒光定量PCR檢測方法檢測體外轉錄RNA模板的擴增曲線Fig.2 Amplification curves of nine 1∶10 dilutions ranging from 107 copies/μL to 10-1 copies/μL for in vitro transcribed RNA for NiV-NP-Q (a) and NiV-NP-UD (b)

圖3 兩種尼帕病毒實時熒光定量PCR檢測方法特異性分析Fig.3 Specificity of two TaqMan real-time RT-PCR methods: (a) NiV-NP-Q, (b) NiV-NP-UD

2.3 兩種尼帕病毒實時熒光定量PCR檢測方法的驗證 從10倍梯度稀釋的尼帕病毒感染細胞上清(107～101TCID50/mL)樣本中提取了病毒RNA，以該RNA為模板對兩種方法進行驗證的結果如圖4所示。以Log TCID50/mL為x軸、Ct值為y軸，分別獲得兩種方法相對應的線性方程，結果顯示兩者之間具有較好的線性關系，且兩種檢測方法的檢測限均可達10 TCID50/mL，具有較高的靈敏度。

圖4 兩種尼帕病毒實時熒光定量PCR檢測方法的驗證及其以病毒RNA為模板的靈敏度分析Fig.4 Sensitivity of two TaqMan real-time RT-PCR methods. Standard curves for NiV-NP-Q (a) and NiV-NP-UD (b) were constructed with seven 1∶10 dilutions of viral RNA extracted from virus infected cell supernatants, ranging from 107 TCID50/mL to 101 TCID50/mL

3 討 論

尼帕病毒被世界衛生組織(WHO)列為對人類最危險的病毒之一，由于其宿主范圍廣泛，傳播性強，感染后病死率高，研發其診斷、預防和治療方法刻不容緩[19-20]。實時熒光定量PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性好、穩定性好、效率高等優點，在診斷方面發揮重要作用。

目前國內外已經建立了一些尼帕病毒的定量PCR檢測方法，與這些方法相比，本研究中的方法具備更好或相當的靈敏度和特異性。王浩等[11]同樣以N基因作為靶基因，建立TaqMan qRT-PCR方法，通過檢測RNA標準品得到的靈敏度為100 copies/μL，與之相比，本研究中的兩種方法具有更高的靈敏度。Jensen等[21]以F和G之間非編碼區基因為靶標建立qRT-PCR檢測方法，分別檢測了尼帕病毒的兩種毒株Malaysia和Bangladesh，以病毒細胞感染樣本為模板，其檢測得到的靈敏度均為10 pfu/mL，計算出相對應的病毒RNA拷貝數為104copies/mL，結果與本研究相似，只是由于可使用的尼帕病毒毒株有限，本研究只針對Bangladesh毒株進行了檢測驗證。Guillaume等[12]以尼帕病毒的N基因為靶標建立了TaqMan探針RT-PCR法，對病毒RNA進行檢測，靈敏度約為1 pfu/mL，由于使用了不同的滴度單位，無法與本研究中涉及的兩種方法進行直接的比較，我們今后可采取同樣的條件優化該方法并進行比較，為NiV的檢測方法提供更多參考。Feldman等[22]建立了TaqMan探針、SYBR Green和巢式3種RT-PCR檢測方法，認為SYBR Green RT-PCR方法成本較低，對于調查大量潛在的未知亨尼帕病毒更經濟實用，TaqMan探針檢測法更加靈敏，但價格較昂貴，用于定量檢測已知亨尼帕病毒更為準確，我們的研究結果也顯示出TaqMan探針法具備靈敏度高、特異性好等特點。

由于此前缺乏病毒來源，前期國內研究人員建立的一些尼帕病毒的定量PCR檢測方法[10-11,17]僅僅使用DNA質粒或者體外轉錄RNA作為陽性模板，對檢測方法的評估具有一定的局限性。而本研究首次在國內利用尼帕病毒感染上清樣本為檢測對象，同時設置了埃博拉病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、乙型腦炎病毒等病毒的感染上清樣本作為對照，對已建立的兩種方法進行了特異性和靈敏度的驗證，可以更為全面和真實地對檢測方法進行評價，以便更好地運用到實際檢測工作中。目前仍缺乏NiV檢測方法的統一標準，尤其是在一些欠發達國家和地區，從而導致很多NiV感染未能得到準確檢測的情況存在[15]，本研究對已經建立的2種方法在同樣檢測條件下進行了比較和驗證，為標準化NiV的核酸檢測方法提供了參考。此外，已有研究顯示高質量的病毒載量檢測對很多DNA或RNA病毒性疾病患者的治療和管理的必要性，如HIV/AIDS領域[23]，病毒感染者體內的病毒載量可能與疾病治療效果和預后有重要提示意義。本研究以已知滴度的病毒液為檢測對象，對梯度稀釋的病毒液進行病毒RNA提取和檢測，建立了病毒滴度和Ct值之間的關系(圖4)，為臨床檢測和治療工作提供了參考。但值得注意的是，當前我們國家沒有尼帕病毒感染的病例報道，缺乏尼帕病毒感染的臨床樣本，因此，今后還需要利用臨床樣本對以上方法進一步評估，以明確實時熒光定量PCR檢測方法對臨床樣本的適用性。

尼帕病毒感染是WHO研發藍圖中的重點疾病。研發藍圖是指在流行病暴發之前或者暴發期間，為了研發診斷工具、疫苗、藥物、療法等相關技術而建立的全球戰略合作和防范平臺。但目前沒有針對尼帕病毒感染的藥物或疫苗，因此，診斷和發現是尼帕病毒防控的第一步。核酸檢測是實驗室常用診斷方法之一，定量PCR法具有操作簡便、檢測高效、靈敏度高、特異性強和穩定性良好等優點，已在病原診斷方面被廣泛應用，成為必不可少的診斷工具之一，特別是在流行病暴發期間。我國已有正在運行的生物安全四級(BSL-4)實驗室，可以開展尼帕病毒等烈性病原相關的藥物和疫苗研究，為未來烈性病原的科研提供相關的技術支持。本研究依托武漢BSL-4實驗室對前期建立的兩種尼帕病毒定量PCR檢測方法進行了比較和評估驗證，為建立優良、高效和穩定的實驗室診斷方法提供了技術支撐。

(感謝武漢國家生物安全實驗室全體工作人員在研究工作中提供的支持和幫助。)

利益沖突：無

引用本文格式：肖舒奇，師永霞，夏菡，等. 兩種檢測尼帕病毒的實時熒光定量PCR方法的比較與效果驗證[J]. 中國人獸共患病學報，38(4)：303-308. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.015