海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化菌對造紙廢水降酚性能的研究

王浩楠 林 濤 王雪青 張安龍 羅 清，*

（1.陜西科技大學輕工科學與工程學院，輕化工程國家級實驗教學示范中心，陜西西安，710021；2.陜西科技大學環境科學與工程學院，陜西西安，710021）

苯酚及其衍生物是制漿造紙[1]、紡織加工、煤氣化、石油精煉等工業廢水中常見的主要有機污染物。其中造紙廢水生化出水中含有27 種有機污染物，包括2,4-二叔丁基苯酚、2,2'-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、雙酚A、2,4,6-三氯苯酚等苯酚類特征污染物[2]。而單體苯酚是苯酚類污染物最簡單的中間體，單體苯酚由于其難降解性和普遍存在性，常被認定為具有酚類代表性的難降解化學污染物[3-4]。在各種去除苯酚的方法中，生物降解法具有成本低、無二次污染、可循環使用等優點，在含酚廢水處理中具有良好的應用前景[5]。

然而，用于生物降解的游離微生物在細胞生長和細胞分離再利用過程中，容易受到環境因素（如培養液pH值和污染物濃度）敏感性的限制[6]。對游離細菌進行固定化處理可增強微生物抵抗極端環境毒性的能力，同時可以實現微生物的快速高效分離。許多有機材料和無機材料都可以作為細菌固定化基質。瓊脂作為一種天然高分子聚合物，由于其膠凝能力強、耐酸，有較高的生物相容性，常被用作有機固定化基質，因此許多研究中使用瓊脂來固定微生物和酶[7]。海藻酸鈉在溫和條件下可與鈣離子交聯，和游離細菌具有較高的相容性，是一種廣泛使用的無毒固定細菌材料[8]。近年來，蒙脫土、高嶺土等黏土礦物作為生物成分的載體和固定基質，因其對細胞無毒害作用和親水性而備受關注[9]。Fang 等人[10]用瓊脂卡拉膠復合納米Fe3O4固定化細菌，研究了材料對細菌的吸附性能和各因素的影響程度，結果發現固定化后可明顯提高降酚速率，且能實現高達50 次的循環利用率。Mandal 等人[11]研究發現膨潤土固定化的分枝桿菌VF1 對酚降解速率有明顯提高，黏土復合材料可以減緩環境對細菌的毒性，從而為細菌的生存創造一個合適的微環境。

本研究利用蒙脫土作為有機復合固定化材料海藻酸鈉-瓊脂凝膠的支持基質，制備海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化微球。研究優化了固定化微球的最佳耦合條件和不同苯酚初始濃度下細菌的降解規律和降解動力學模型，以確定苯酚降解動力學參數；探究了極端pH 條件下固定化微球的苯酚降解效果和固定化微球的循環利用性能及存儲穩定性。

1 實 驗

1.1 實驗菌株、培養條件和試劑

1.1.1 實驗菌株

實驗使用的苯酚降解菌株為革蘭氏陰性短粗桿菌Klebsiella pneumoniaeZS01，來自于本實驗室（-80℃超低溫冷凍儲存冰箱）。

1.1.2 培養條件

（1）菌株在pH 值為7 的MPYE 培養基中進行富集，每升培養基中含有3 g 魚粉蛋白胨，3 g 酵母膏，1 g CaCl2·2H2O，1.6 g MgCl2，在恒溫搖床中以150 r/min的轉速在35℃下進行培養。菌株生長24 h 后，在4℃下以8000 r/min 的轉速離心5 min 去除上清液來收集細菌。用無菌水通過紫外可見分光光度計在600 nm下將細菌濃度調整到0.8，用于細菌固定化。

（2）在苯酚降解過程中，富集菌株在35℃的Me?dA 培養基中生長，每升培養基中含有：2 mL 質量分數2%天冬氨酸、20 mL pH 值為6.8 的Solution C 溶液（10 g 氮川三乙酸，3.33 g CaCl2，29.5 g MgSO4·7H2O，93 mg (NH4)6Mo7O24·4H2O，99 mg FeSO4·7H2O，50 mL微量元素溶液）、1.25 g L-谷氨酸、10 mL 質量分數10% NaCl。培養基用1 mol/L KOH 和1 mol/L HCl 溶液將其pH 值調至7.0～7.3 后120℃高溫滅菌30 min，然后用微孔濾膜加入10 mL 維生素溶液、20 mL 磷酸鹽緩沖溶液（將KH2PO4溶液加入到K2HPO4溶液中至pH值為6.8）。

（3）苯酚原液的配制：取一定量的苯酚將其配制成6 g/100 mL的苯酚原液并置于4℃冰箱中保存備用。

1.1.3 試劑

蒙脫土（240 m2/g）、海藻酸鈉、瓊脂和苯酚試劑均購自上海阿拉丁生化科技有限公司；其他化學品均為分析純或色譜純；所有培養基和實驗材料均預先在120℃下高壓滅菌。

1.2 實驗儀器

立式蒸汽壓力滅菌鍋，型號SN510C，重慶雅瑪拓科技有限公司；生物安全柜，型號AC2-4S1，新加坡ESCO 科技有限公司；雙層恒溫搖床，型號QYC-210C，江蘇盛藍儀器制造有限公司；離心機，型號3k15，上海斯信生物科技有限公司；紫外可見分光光度計，型號UV759，上海佑科儀器儀表有限公司；環境掃描電子顯微鏡（ESEM），型號S4800，日本理學。

1.3 實驗方法

1.3.1 固定化微球的制備

將蒙脫土和瓊脂溶解在去離子水中，混合分散加熱至100℃后，加入海藻酸鈉，不斷加熱攪拌30 min，至水凝膠混合均勻，并且確保水凝膠不含氣泡。混合均勻的水凝膠溶液在121℃的高壓滅菌鍋中滅菌30 min，將富集菌株加入至滅菌后冷卻的水凝膠溶液（約40℃）中并充分混合均勻。通過注射器將均質水凝膠溶液滴入滅菌的CaCl2（4% 質量/體積）中，制備直徑約3 mm、質量約50 mg 的水凝膠珠，于4℃冰箱中固定化12 h。固定的水凝膠珠用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=7.2）至少洗滌3次以去除微球上殘留的鈣離子，制得海藻酸鈉-蒙脫土-瓊脂固定化微球。制備的固定化微球儲存在4℃中以備后用。

1.3.2 苯酚降解實驗

為更好地研究固定化微球的降解效果，首先探究了影響固定化微球生物降解苯酚性能的4個因素。根據前期預實驗結果，在進行單因素實驗時，對不同影響因素采用一定遞增比例的濃度進行批量實驗。將不同濃度的固定化微球和滅菌苯酚加入裝有100 mL 滅菌MedA培養基的250 mL錐形瓶中，使苯酚濃度達到1000 mg/L。將所有燒瓶用滅菌封口膜密封以防止苯酚氧化，然后置于35℃、150 r/min的恒溫培養箱中降解。定期收集樣品，并測量殘留苯酚濃度。

在上述最佳條件下，還研究了固定化微球在苯酚作為唯一碳源時，苯酚降解性能最優時的苯酚初始濃度。在不同苯酚初始濃度（200、400、600、800、1000 mg/L）條件下，接種相同濃度的游離細菌作為對比實驗，將它們與固定化微球的降酚性能進行比較。定期收集樣品測量苯酚的殘留濃度。苯酚降解數據用于計算苯酚降解的比降解速率和降解動力學分析。

1.4 分析方法

殘留苯酚濃度采用4-氨基安替比林法測定[12]。采用比濁法對培養液中的生物量進行測定（OD600）。

1.5 苯酚降解動力學

一階動力學通常用于描述不同污染物的生物降解。基于1.4 研究結果，使用偽一級模型評估苯酚降解過程的降解動力學。一階動力學速率方程見式(1)和式(2)。

式中，St為t時刻苯酚濃度，mg/L，S0為苯酚初始濃度，mg/L，μ為比降解速率，h-1。生物降解率（dS/dt）由生物量指數生長階段苯酚濃度隨時間的斜率決定。

Haldane 模型[13]被擬合到實驗數據中，以表示本研究中游離細菌和固定化微球對苯酚的降解動力學，見式(3)。

式中，μmax為最大比降解速率，h-1，S0為苯酚初始濃度，mg/L，Ks為底物親和常數，mg/L，Ki為底物抑制常數，mg/L。Ki值較大表示微生物對底物抑制的敏感性較低。通過使用非線性回歸[14]計算相應的苯酚初始濃度和μ，獲得動力學參數和擬合曲線。

1.6 重復使用性和貯存穩定性

將固定化微球加入到含有1000 mg/L 苯酚的100 mL MedA 培養基中，每次循環時間一直持續到苯酚降解完成。每次生物降解過程結束后，棄去之前的培養基，用無菌水徹底清洗固定化微球3次，然后將其轉移到含有1000 mg/L 苯酚的100 mL MedA 新鮮培養基中，進行循環降解實驗。

為了評估固定化微球的貯存穩定性，將固定化微球和含有相同濃度的游離細菌同時在4℃的冰箱中儲存5～30 天，然后在苯酚濃度為1000 mg/L 進行降解實驗。

2 結果與討論

2.1 游離細菌和固定化微球的表面形態及ESEM 形貌特征

2.1.1 表面形態

圖1(a)為海藻酸鈉微球的表面直觀圖，由圖1(a)可以看出，海藻酸鈉具有很好的成球性，呈透明白色狀。圖1(b)為固定化微球的表面直觀圖，復合瓊脂和蒙脫土后，微球變為不透明乳白色，形狀規則，球體大小均勻。圖1(c)為固定化微球重復使用5 次后的外觀圖，經5次循環后，微球外觀已變成黃色，這是因為微球內部繁殖生長出大量的細菌細胞，且實驗室細菌為黃色，因此固定化微球也變成黃色。

2.1.2 ESEM分析

圖2(a)～圖2(d)為游離細菌、不同固定材料及固定化微球的橫截面形貌圖。由圖2(a)可以看出，海藻酸鈉微球內部包含不規則的交聯網絡結構，結構類似于先前研究得出的結論[15]。由圖2(b)可以看出，此時海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土微球內部變成了更為緊湊的片狀網絡結構。可見瓊脂和蒙脫土與海藻酸鈉交聯后，微球內部孔隙增多，一方面為細菌的附著和固定提供了更大的比表面積，另一方面也增加了底物的傳質效率，也有利于營養物質的傳輸和新陳代謝產物的排出。對比游離細菌（圖2(c)）的形貌圖，說明固定化微球（圖2(d)）內部有大量細菌成功附著。

2.2 單因素實驗

2.2.1 海藻酸鈉質量分數

圖1 不同材料的形態Fig.1 Appearance of different materials

圖2 不同固定材料及其固定化微球的ESEM圖Fig.2 ESEM images of different immobilized materials and immobilized microphere

本研究將海藻酸鈉滴入質量分數4%CaCl2溶液中形成凝膠微球，研究了不同海藻酸鈉質量分數對苯酚降解的影響。圖3(a)為海藻酸鈉質量分數對苯酚降解速率的影響。由圖3(a)可知，海藻酸鈉質量分數為1%的固定化微球苯酚達到最大降解速率（18.18 mg/（L·h））。隨著海藻酸鈉質量分數的增加，交聯網絡結構增多，固定化微球內部比表面積增大，為微生物提供了足夠的吸附、生長、繁殖的空間，從而提高了微生物傳質效率。海藻酸鈉質量分數增加至1.5%時，導致固定化微球的苯酚降解速率下降（15.87 mg/（L·h）），說明高質量分數海藻酸鈉會使固定化微球內部過飽和，阻礙底物分子通過微球內部擴散，降低細菌對苯酚的降解速率[16]。綜上，制備固定化微球海藻酸鈉的最佳質量分數為1.0%。

2.2.2 蒙脫土質量分數

不同蒙脫土質量分數對苯酚降解的影響結果見圖3(b)。由圖3(b)可知，當蒙脫土質量分數從0 增加到1.0%時，苯酚降解速率緩慢增加。當蒙脫土質量分數為1.5%時，苯酚降解速率達最大值17.85 mg/（L·h）。這是因為蒙脫土可以吸收少量苯酚，減輕苯酚對細胞的毒性，為細菌生存創造良好的微環境。在固定化微球中加入蒙脫土可以提高其機械強度、滲透性[15]。但當蒙脫土質量分數增加至2.0%時，苯酚降解速率與低質量分數蒙脫土苯酚降解速率相當，約（16 mg/（L·h）），這可能是由于固定化微球中高質量分數的蒙脫土堵塞了微球的內部孔隙，阻礙了細菌的生長和底物的擴散，從而抑制了降解細菌的活性。綜合考慮，固定化微球中蒙脫土的最佳質量分數為1.5%。

2.2.3 瓊脂質量分數

瓊脂質量分數對固定化微球降解苯酚性能的影響如圖3(c)所示。由于瓊脂質量分數增高（0.5%、1.0%），固定化微球的片狀網絡結構增加，固定化微球內部平均孔徑增加，機械強度和穩定性也隨之增加，固定化細菌的數量也隨之增加，細菌降解苯酚的速率進一步提高，這一結果在Rehman 等人[17]的研究中也有體現。當瓊脂質量分數過高時（2.0%），固定化微球內部變得更為致密，導致內部孔徑減小，也影響了底物擴散到固定化微球內部的速度，從而降低了苯酚的降解效率。因此，制備固定化微球的最佳瓊脂質量分數為1%。

2.2.4 細菌接種量

不同包埋細菌濃度（體積分數10%～30%）(OD600為0.8)對苯酚降解速率的影響結果如圖3(d)所示。由圖3(d)可知，隨著細菌接種量的增加，苯酚的降解速率逐漸增加。細菌接種量從20%增加至25%時，苯酚降解速率迅速增加到18 mg/（L·h），這是因為細菌細胞對高濃度苯酚的適應性逐漸增強，導致細菌細胞增殖更快，生物降解效率更高。當接種量升高至30%時，降解速率并未顯著提高，大量細菌在微球內部迅速繁殖導致微球過飽和，此時不僅影響微球的機械穩定性，也會導致細菌從微球泄露到溶液中，影響后續循環降解實驗[18]。綜合上述因素，制備固定化微球的最佳細菌接種量為25%。

2.2.5 正交實驗

根據單因素實驗結果，采用正交實驗考察影響固定化微球各因素之間的交互作用，從而確定最優的細菌固定化條件，正交因素水平如表1所示。

表1 固定化微球降解苯酚正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment on degradation rate of phenol by immobilized microspheres

圖3 影響苯酚降解速率的因素Fig.3 Factors affecting the degradation rate of phenol

Ki值表示該列因素水平為i時所對應的實驗結果總和，可以判斷某個因素的最優水平和最優組合；R值表示某個因素水平的極差，反應某個因素水平波動時，實驗結果的變動幅度，R值越大，該因素對實驗結果的影響越大，可以判斷因素的主次順序。以固定化微球對苯酚的降解速率為考察指標，正交實驗結果如表2 所示。由表2 可知，影響固定化微球對苯酚降解速率因素的主次順序為：海藻酸鈉質量分數＞細菌接種量＞瓊脂質量分數＞蒙脫土質量分數。正交實驗得出制備固定化微球的最優組合為：海藻酸鈉質量分數1.0%，蒙脫土質量分數1.5%，瓊脂質量分數1.0%，細菌接種量25%。在最優固定化條件下制備固定化微球，固定化微球可在60 h內完全降解1000 mg/L的苯酚，苯酚降解速率為16.67 mg/(L·h)。

表2 固定化微球降解苯酚正交實驗結果Table 2 Orthogonal test results and analysis of degradation rate of phenol by immobilized microspheres

2.3 苯酚初始濃度的影響

在最優海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化條件下制備固定化微球后，固定化微球在不同苯酚初始濃度下的苯酚降解過程如圖4 所示。由圖4 可知，固定化微球在60 h 內對不同初始濃度下的苯酚可以全部有效降解，而游離細菌降解完成則需要72 h（降解速率為13.89 mg/（L·h））。首先，固定化微球對苯酚有一定的吸附作用，所以固定化微球在前6 h，苯酚濃度均有明顯下降。不同的是在低苯酚初始濃度（0～400 mg/L）的條件下，苯酚濃度的降低實際上與時間呈線性關系，因此，在線性范圍內對于給定的苯酚初始濃度，降解速率是恒定的。但在高濃度條件下（400～1000 mg/L），固定化微球的降解存在一定的滯后期（大概12 h左右），這是由于高濃度苯酚對細菌降解的抑制作用，因此苯酚濃度隨時間的下降呈非線性。游離細菌的降解規律與固定化微球有很大的相似性，但不同的是游離細菌有長達24 h滯后期。對細菌進行固定化處理在一定程度上可以降低高濃度苯酚直接接觸對細菌降解產生的抑制作用，因此固定化后明顯降低了細菌降解苯酚的遲滯期。

2.4 苯酚降解動力學

在指數生長階段測定了200～1000 mg/L 苯酚初始濃度的一級生物降解動力學參數，結果如表3 所示。由表3可知，隨著苯酚初始濃度的增加，固定化微球在400 mg/L時比降解速率達到最大值。

圖4 苯酚初始濃度對固定化微球和游離細菌降解苯酚的影響Fig.4 Effect of the initial concentration of phenol on the degradation of phenol by immobilized micropheres and free bacteria

表3 游離細菌和固定化微球對苯酚的一級降解動力學參數Table 3 Parameters of first-order biodegradation kinetics of phenol by free bacteria and immobilized micropheres

圖5 游離細菌和固定化微球比生長率擬合曲線Fig.5 Fitting curve of specific growth rate of free bacteria and immobilized micropheres

將上述比降解速率與其對應的苯酚初始濃度通過非線性曲線擬合，確定游離細菌和固定化微球的比生長率擬合曲線圖以及模型預測的動力學參數見圖5。由圖5 可知，游離細菌（R2=0.944）和固定化微球（R2=0.953）的實驗數據和模型預測均具有較高的相關系數。數據擬合Haldane 模型得到的動力學參數值表明固定化微球獲得的預測μmax值（0.257 h-1）顯著高于游離細菌μmax（0.198 h-1），表明固定化微球具有更高的苯酚降解性能。游離細菌苯酚比降解速率在苯酚初始濃度約100～200 mg/L 時達到最大值，而固定化微球的比降解速率在苯酚初始濃度200～300 mg/L時達到最高；苯酚的進一步增加導致μ的減少，表明高濃度苯酚對生物降解能力有相當大的抑制作用。固定化微球可以耐受高濃度的苯酚，在1000 mg/L 時固定化微球μ約為0.07 h-1，而游離細菌μ為0.04 h-1。模型參數顯示固定化微球的底物抑制常數Ki（402.5）大于游離細菌Ki（233.1），說明固定化微球對苯酚抑制的敏感性低于游離細菌。這是因為固定化微球內部由有機-無機耦合形成的交叉網絡結構可以作為苯酚對細胞毒性的有益物理屏障，從而降低底物對細菌抑制作用的敏感性，增強細菌在高苯酚初始濃度下的降酚能力[19]。

2.5 苯酚在強酸性和強堿性條件下降解

培養液的pH 值影響細菌的酶活性，進而影響微生物的生長速度，以及降酚菌對苯酚的降解效率。極端pH 環境下對固定化微球降解苯酚初始濃度為1000 mg/L 的影響見圖6。圖6(a)顯示當pH 值為1 時，游離細菌完全不能降解苯酚，這是由于強酸性容易導致酶失活，相同條件下固定化微球則可以完成降解，但降解所需時間長達78 h；pH值為3時固定化微球完成降解時間也需68 h。以上結果表明，復合固定化材料有效地保護了細菌的活性。圖6(b)顯示當pH 值提高到10 和12，游離細菌對苯酚有一定程度的降解，同時固定化微球也能在相同條件下保持較高的降解效率（pH 值為10和12時，完成降解時間分別為60 h和68 h）。固定化微球在pH值為10的降解效率最高，這可能是由于苯酚降解過程中的酸性代謝物與培養基中的堿性化合物發生中和反應，從而自動調整了反應系統中的pH[20]。結果表明，固定化微球作為屏障，可以保護內部細菌免受極端環境的侵害，固定化后細菌對酸性和堿性環境均具有較好的適應性。

2.6 固定化微球的重復使用性和儲存穩定性

2.6.1 重復使用性

圖6 極端pH值對游離細菌和固定化微球降解苯酚的影響Fig.6 Effect of extreme pH on the degradation of phenol by free bacteria and immobilized micropheres

圖7 循環周期中固定化微球的苯酚降解速率與細菌活性Fig.7 Degradation rate and cell viability of immobilized micropheres in the cycle

重復使用性是固定化微球的一個重要考察指標，循環周期中固定化微球苯酚降解速率和細胞活性見圖7。如圖7(a)所示，在前6 個循環中苯酚降解速率迅速增加，苯酚降解速率從16.67 mg/（L·h）增加到45.45 mg/（L·h），此時固定化微球降酚效率處于穩定期，降解時間維持在22 h。由圖7(b)可知，設定初始細菌活性為100%，相對活性以其初始活性的百分比表示，循環周期中固定化微球的相對活性與苯酚降解速率的趨勢是一致的，重復培養時細菌分泌大量胞外聚合物，形成了生物膜，為重復苯酚降解提供適當的環境[19]。后期降解效率略微下降，這可能是因為固定化微球中細菌生物質的最大量，限制了底物轉移到微球內部中。實驗過程中觀察發現，珠粒的形態基本保持完整的形態，直到32 次循環結束，珠子結構完全被破壞，循環終止。

2.6.2 儲存穩定性

固定化微球的儲存穩定性是其是否能被工業化大規模應用的重要考量因素之一。圖8為固定化微球和游離細菌的儲存穩定性。如圖8所示，隨著儲存時間的延長，固定化微球保持穩定的苯酚降解率，在4℃下儲存30 天后依然可以去除99%的苯酚。微球內的細菌保持生理穩定性且微球具有較高的機械強度。相比之下，游離細菌的苯酚降解率在超過15 天后急劇下降，甚至在30 天后失去活性。以上結果表明固定化微球具有很強的儲存穩定性，可以重復使用，在實際應用中具有巨大的潛力。

圖8 固定化微球和游離細菌的儲存穩定性Fig.8 Storage stability of immobilized micropheres and free bacteria

3 結 論

本研究制備了海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化微球苯酚降解菌，以苯酚降解速率為考察指標，探究了最佳固定化條件及各因素對苯酚降解速率的影響。

3.1 以海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土凝膠微球為載體制備固定化微球的最佳條件為：1.0%海藻酸鈉、1.5%蒙脫土、1.0%瓊脂和25%細菌接種量。與游離細菌苯酚降解速率（13.89 mg/(L·h)）相比，固定化微球的苯酚降解速率（16.67 mg/(L·h)）顯著提高。

3.2 細菌的生物降解能力受苯酚初始濃度影響較大。較高的苯酚初始濃度會抑制生物量，降低生物降解率。固定化微球在60 h 內對1000 mg/L 的苯酚有較好的降解效果，而在相同條件下游離細菌降解則需要72 h。Haldane 抑制模型顯示，固定化可以顯著降低細菌對苯酚抑制的敏感性。

3.3 極端酸堿性條件下，固定化微球的降酚性能體現了顯著的優越性，可以承受更廣泛的酸性變化，并在堿性條件下保持較高的降解效率。

3.4 固定化微球可重復使用32 次，在4℃保存30 天后，依舊可以去除99%的苯酚。