基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間技術(shù)的兩種質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)于臨床常見菌株鑒定能力的研究

張宇瓊，陸文香，袁 壚，陳海鵬，張國棟

1.蘇州市立醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州 215000；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州 215000

2008年MALDI-TOF MS系統(tǒng)首次被臨床微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛用于細(xì)菌鑒定［1-3］。近來有研究表明，該技術(shù)不僅能快速鑒定常見細(xì)菌，對(duì)于通常難以識(shí)別的物種，例如酵母菌，厭氧菌和苛養(yǎng)菌也能鑒定出來［4-5］。目前，兩大質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)，Bruker microflex和Vitek MS已在全球臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用，用于常見細(xì)菌和酵母菌株的常規(guī)鑒定。隨著MALDI-TOF MS系統(tǒng)在國內(nèi)外臨床微生物鑒定中廣泛應(yīng)用，臨床用戶對(duì)儀器的需求越來越迫切，但由于進(jìn)口儀器價(jià)格及其維護(hù)成本較高，使得許多基層醫(yī)院望而卻步。本研究旨在比較并評(píng)估安圖Autof ms1000和布魯克Microflex LT兩個(gè)系統(tǒng)在臨床常見微生物鑒定的準(zhǔn)確性和臨床實(shí)用性方面的表現(xiàn)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)株 35株標(biāo)準(zhǔn)菌株和室內(nèi)質(zhì)控/室間質(zhì)評(píng)菌株（涵蓋革蘭氏陰性桿菌、陽性球菌、陽性桿菌以及需氧和厭氧菌），均已經(jīng)16/18SrDNA或ITS測(cè)序鑒定，共22個(gè)菌屬、34個(gè)不同的菌種。

1.1.2 臨床株 收集蘇州市立醫(yī)院2018年11月—2019年2月臨床樣本分離的菌株共3 312株。樣本類型包括尿液、痰液、腦脊液、胸腹水、創(chuàng)口分泌物、陰道分泌物及血液等。

1.1.3 儀器與試劑 試劑：羥基肉桂酸（CHCA）、標(biāo)準(zhǔn)品IVD Bacterial Test Standard（德國Bruker公司）。乙腈、三氟乙酸、甲酸和無水乙醇（美國Sigma公司）。血平板、麥康凱平板、巧克力平板及沙保弱平板（中國安圖生物公司）。厭氧產(chǎn)氣包（法國生物梅里埃公司）。儀器：Microflex LT（德國Bruker公司）。Autof ms1000（中國安圖生物公司）。二氧化碳恒溫孵育箱（美國Thermofisher公司）。超速離心機(jī)（安徽中科中佳儀器有限公司）。

1.2 方法

（1）質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置。MALDI-TOF MS鑒定使用前采用標(biāo)準(zhǔn)品BTS進(jìn)行校正。安圖MALDI-TOF MS分析：MALDI-TOF MS系統(tǒng)以線性正性模式，采集相對(duì)分子質(zhì)量2～20 kD的圖譜，結(jié)合預(yù)安裝在儀器中的分析軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析。布魯克MALDI-TOF MS分析：MALDI-TOF MS系統(tǒng)同樣以線性正性模式，采集相對(duì)分子質(zhì)量2～20 kD的圖譜，結(jié)合Biotyper 3.0軟件進(jìn)行分析。（2）質(zhì)譜上機(jī)操作。分別依據(jù)制造商說明書和“中國臨床微生物質(zhì)譜應(yīng)用專家共識(shí)”［6］進(jìn)行質(zhì)譜操作。常規(guī)細(xì)菌，挑取平板上培養(yǎng)的單個(gè)菌落均勻涂抹在靶板上，滴加1 L基質(zhì)液，室溫干燥后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。若懷疑為念珠菌，則先滴加1 L的70%甲酸溶液，徹底干燥后再滴加1 L基質(zhì)液，室溫干燥后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。若有絲狀真菌需要鑒定，則利用甲酸乙腈提取法預(yù)處理細(xì)菌，取1 L提取液點(diǎn)至靶上，徹底干燥后再滴加1 L基質(zhì)液，室溫干燥后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。（3）分值說明。①安圖數(shù)據(jù)庫內(nèi)現(xiàn)有菌株達(dá)9 050株，超過370個(gè)屬，共計(jì)2 613種。鑒定分?jǐn)?shù)為10分制，分值≥9.5分為種水平置信，可能的亞種。分值在9.0～9.5分為種水平置信。分值6.0～9.0分為屬水平置信。分值＜6.0分為不可信。②布魯克主庫內(nèi)現(xiàn)有菌株數(shù)5 989株，2 371種。鑒定分?jǐn)?shù)為3分制，評(píng)分≥2.3分為種水平高度可信。分值2.0～2.3分為屬水平可信，種水平參考。分值1.7～2.0分為屬水平參考。分值＜1.7分為不可信。（4）結(jié)果判定。“正確鑒定到種”即質(zhì)譜鑒定結(jié)果與參考方法在種水平上一致。“正確鑒定屬”即質(zhì)譜鑒定結(jié)果與參考方法在屬水平上一致。“不可信的鑒定”為質(zhì)譜鑒定分值均＜6.0分或＜1.7分。“誤鑒定”為質(zhì)譜鑒定分值為種水平可信，但結(jié)果與實(shí)際菌株名稱不一致。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)株鑒定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中WSB1512鼠傷寒沙門菌和WSB1703牛沙門氏菌鑒定為Salmonella sp，WSB1507星型諾卡氏菌鑒定為Nocardia sp，WSB1610牛鏈球菌鑒定為Streptococcus gallolyticus，經(jīng)查閱文獻(xiàn)［7］及專家共識(shí)，這是由于MALDI-TOF MS方法本身的局限性導(dǎo)致無法區(qū)分。以上均視為準(zhǔn)確鑒定。而WSB1611宋內(nèi)志賀氏菌兩個(gè)系統(tǒng)均鑒定為大腸埃希氏菌，雖然是由于方法學(xué)局限導(dǎo)致，但還應(yīng)算誤鑒定。而Microflex LT誤將WSB非O1，O139霍亂弧菌Vibrio cholerae誤鑒定為Vibrio albensis。以上結(jié)果修正后，結(jié)果提示Autof ms1000和Microflex LT二個(gè)質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果存在一致性，但是一致性較差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Kappa=0.36，P=0.017）。Autof ms1000和Microflex LT種水平鑒定準(zhǔn)確性分別為85.7%和71.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.044），見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)株MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果 株

2.2 臨床菌株總的鑒定結(jié)果

對(duì)于3 312株臨床菌株來說，Autof ms1000和Microflex LT二者的鑒定情況存在一致性，但一致性一般，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Kappa=0.452，P＜0.001）。Autof ms1000種水平鑒定準(zhǔn)確性為85.0%，明顯高于Microflex LT（69.9%）；二者屬水平鑒定準(zhǔn)確性分別為96.4%和94.3%；不可信菌株數(shù)分別為115株（3.5%）和182株（5.5%）。對(duì)于除酵母菌和絲狀真菌外的2 727株臨床細(xì)菌來說，二者屬水平鑒定準(zhǔn)確性分別為95.7%和96.6%，種水平鑒定準(zhǔn)確性分別為85.7%和79.1%。

2.3 臨床常見細(xì)菌鑒定結(jié)果

1 369株常見革蘭氏陰性菌（腸桿菌科細(xì)菌和非發(fā)酵菌）中，有9株沙門氏菌只鑒定到沙門氏菌屬，是因?yàn)槭躆ALDI-TOF系統(tǒng)限制，目前只能鑒定到屬水平［8］。Autof ms1000和Microflex LT種水平鑒定準(zhǔn)確性分別為83.4%和81.2%。920株常見革蘭氏陽性球菌（葡萄球菌，腸球菌和鏈球菌）中，Autof ms1000和Microflex LT種水平鑒定準(zhǔn)確性分別為93.6%和80.2%，見表2。

表2 3 312株臨床菌株MALDI-TOFMS鑒定結(jié)果 株

2.4 真菌的鑒定結(jié)果

570株念珠菌中，Autof ms1 000和Microflex LT屬水平鑒定準(zhǔn)確性分別為99.6%和84.9%，種水平鑒定的準(zhǔn)確性分別為81.6%和27.2%。不可靠的鑒定比例分別為0.3%和15.1%。在15株其他真菌中，Autof ms1 000和Microflex LT屬水平鑒定準(zhǔn)確性分別為100.0%和40.0%。種水平鑒定準(zhǔn)確性分別為86.7%和6.7%，見表3。

表3 570株念珠菌的鑒定結(jié)果 株

2.5 臨床不常見細(xì)菌鑒定結(jié)果

在170株（兼性）厭氧菌中，Autof ms1 000和Microflex LT種水平鑒定準(zhǔn)確性分別為74.1%和68.8%。其他160株菌，二者種水平鑒定準(zhǔn)確性分別為65.6%和64.4%，見表4。

表4 其他真菌的鑒定結(jié)果 株

2.6 誤鑒定細(xì)菌結(jié)果

Autof ms1000和Microflex LT鑒定不一致的結(jié)果共有7株，根據(jù)16SrDNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者鑒定錯(cuò)誤的比率分別為71.4%和85.7%。

3 討論

本研究首次對(duì)安圖Autof ms1000系統(tǒng)與Microflex LT系統(tǒng)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中關(guān)于常見細(xì)菌和真菌鑒定能力進(jìn)行了比較。研究結(jié)果表明，總體上，Autof ms1000和Microflex LT兩種質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)臨床常見細(xì)菌屬水平鑒定的準(zhǔn)確性均超過94%，與前人研究結(jié)果相似。同時(shí)當(dāng)臨床樣本擴(kuò)大后，二者對(duì)于菌株鑒定結(jié)果的一致性由較差升為一般，即二者對(duì)于菌株的鑒定結(jié)果基本一致。而Autof ms1000種水平鑒定的準(zhǔn)確性明顯高于Microflex LT卻都略低于前人的研究［1,9,10］。而除念珠菌和絲狀真菌外的2 727株一般細(xì)菌中，二者種水平鑒定準(zhǔn)確性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，是由于其中某些種屬的菌株所占比例較大而其MS分值較低，從而可能會(huì)導(dǎo)致總的種水平鑒定準(zhǔn)確性較低。深入分析發(fā)現(xiàn)，酵母菌和絲狀真菌是Microflex LT系統(tǒng)產(chǎn)生不可靠鑒定結(jié)果的主要菌株。本研究發(fā)現(xiàn)，在570株念珠菌中，Microflex LT種水平鑒定準(zhǔn)確性僅為27.2%（MS評(píng)分≥2分），與Hyun等［11］研究結(jié)果一致，而Autof ms1000為81.6%。當(dāng)選取MS評(píng)分≥1.7分時(shí)，Microflex LT鑒定準(zhǔn)確性提高到84.9%，這與Pence等［3］研究結(jié)果一致，即對(duì)于臨床常規(guī)念珠菌的鑒定最優(yōu)選取1.7分作為臨界值，而此時(shí)Autof ms1000高達(dá)99.7%，同時(shí)證實(shí)甲酸直接涂布法在臨床簡(jiǎn)便可行。本次研究中，真菌在所有菌株中所占比例達(dá)17.2%，且主要來自生殖道分泌物和痰標(biāo)本，其快速準(zhǔn)確的鑒定對(duì)于改善臨床患者預(yù)后極為重要，而安圖Autof ms1000在真菌鑒定上更具優(yōu)勢(shì)。可能是由于其是最新研發(fā)上市且擁有具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中國本土化的真菌數(shù)據(jù)庫以及一些少見的特色菌株。尤其是絲狀真菌，因其包含有不同生長(zhǎng)時(shí)間段的真菌譜圖而更豐富、全面，而布魯克質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)上市較早，本實(shí)驗(yàn)室

數(shù)據(jù)庫未及時(shí)更新以及特定峰值數(shù)量較少而導(dǎo)致無法準(zhǔn)確鑒定。Dupont等［12］研究表明，102株絲狀真菌中，布魯克Microflex LT種水平鑒定準(zhǔn)確性為16.7%，屬水平鑒定準(zhǔn)確性為42.2%。本次研究中，Autof ms1000和Microflex LT對(duì)于其他15株真菌種水平鑒定準(zhǔn)確性分別為86.7%和6.7%，屬水平鑒定準(zhǔn)確性分別為100.0%和40.0%。與前人研究結(jié)果一致。不常見細(xì)菌中，對(duì)于厭氧菌種水平鑒定的準(zhǔn)確性二者有可比性。

關(guān)于7株鑒定結(jié)果不一致的菌株，Autof ms1000和Microflex LT鑒定錯(cuò)誤的菌株數(shù)分別為5株和6株。Kivanc等［9］研究結(jié)果中，Vitek-MS系統(tǒng)和布魯克Microflex LT的誤鑒定率分別為0.4%和0.3%，本研究結(jié)果與其一致。對(duì)不一致菌株進(jìn)行16s rDNA測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，鑒定錯(cuò)誤的幾個(gè)菌株，均為同一菌屬的不同菌種。MALDI-TOF MS系統(tǒng)鑒定微生物是基于系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中已記錄存在蛋白質(zhì)波峰譜圖，而這些譜圖的形成主要基于核糖體蛋白質(zhì)，因此MALDI-TOF系統(tǒng)對(duì)于相近菌種間的區(qū)分具有內(nèi)在局限性，如沙門氏菌屬，腸桿菌科細(xì)菌及枸櫞酸桿菌屬間的區(qū)分。這些密切相關(guān)的菌種區(qū)分對(duì)臨床影響不大，一般來說，臨床上很少有因?yàn)镸ALDI-TOF MS系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫的局限而需要進(jìn)行分子測(cè)序鑒定的菌株。本次研究的局限性在于不常見菌的鑒定較少，包括絲狀真菌，厭氧菌和分枝桿菌等的鑒定。MALDI-TOF MS識(shí)別酵母菌和絲狀真菌的能力已被多次證明。對(duì)于MALDI-TOF MS用于分枝桿菌的鑒定能力，還需要進(jìn)一步的研究來確定，但Saleeb等［13］最近的研究已經(jīng)取得了顯著成效。

綜上所述，兩個(gè)質(zhì)譜系統(tǒng)都可以勝任臨床常見細(xì)菌的鑒定工作。Autof ms1000在念珠菌的鑒定方面，具有一定的優(yōu)勢(shì)。尤其在新型冠狀病毒肺炎疫情期間，快速而準(zhǔn)確的細(xì)菌鑒定，不僅可以減少工作人員暴露時(shí)間，避免造成醫(yī)務(wù)人員自身感染，還能及時(shí)將藥敏結(jié)果及時(shí)反饋與臨床，對(duì)于合并細(xì)菌感染的重癥患者的用藥具有指導(dǎo)意義。但本研究樣本量不足，實(shí)驗(yàn)環(huán)境及不同人員的操作差異也可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，后續(xù)仍需擴(kuò)大臨床樣本量進(jìn)行近一步分析。同時(shí)二者數(shù)據(jù)庫仍需不斷完善和擴(kuò)充，后續(xù)能對(duì)疑難菌及少見菌的鑒定提供建設(shè)性建議，有效縮短菌株鑒定時(shí)間，為臨床用藥及診療提供準(zhǔn)確可靠的鑒定依據(jù)。