MDM2及P53在甲狀腺濾泡癌中的表達及與甲狀腺濾泡癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性

任魯寧 王歡 朱占勝 霍建平 劉克毅 鄭通 柴芳

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院甲狀腺外科，遼寧 錦州 121012)

甲狀腺濾泡癌(FTC)是常見的內(nèi)分泌腫瘤之一，其在甲狀腺癌中的占比約10%，惡性程度較高〔1〕。近年來，濾泡性甲狀腺癌的性別差距正在縮小且變得更具侵略性〔2〕。目前主要的術(shù)前診斷方法為超聲及細針穿刺細胞學(xué)檢查，但都存在局限性〔3〕。故尋找甲狀腺濾泡癌新的診斷方法及治療靶點成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。鼠雙微蛋白(MDM)2是一種E3連接酶，能針對各種基物進行泛素化反應(yīng)，對腫瘤細胞的增殖有積極作用〔4～6〕。P53是腫瘤抑制因子，其突變體對腫瘤的增殖、侵襲、遷移都有積極作用。本實驗通過檢測P53蛋白及MDM2蛋白在FTC中的表達情況，分析二者與臨床病理特征之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1資料 選擇2004～2020年錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治并進行手術(shù)治療，經(jīng)病理學(xué)檢查確診為 FTC患者56例。年齡42～72歲。納入標準：①所有樣本由兩位高年資病理科醫(yī)師進行診斷；②所有患者術(shù)前未行內(nèi)分泌及放化療治療；③按照 2017 年美國癌癥聯(lián)合會標準進行臨床分期。排除標準：①合并橋本病等甲狀腺疾病；②有甲狀腺癌家族遺傳史；③合并甲狀腺橋本病或其他甲狀腺疾病。本實驗經(jīng)本院倫理委員會同意。

1.2主要試劑 兔抗人MDM2(WL01906，Wanleibio，中國)、兔抗人P53(WL01919，Wanleibio，中國)、辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG(111-035-003，Jackson ImmunoResearch，美國)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB，DAB-1031，邁新試劑，中國)。

1.3實驗方法 采用免疫組織化學(xué)染色法，經(jīng)10%甲醛固定后行脫水，包埋，切片，厚度為4 μm。檢測MDM2蛋白和P53蛋白表達情況。一抗及二抗按照1∶200比例進行稀釋，按照說明添加修復(fù)液進行微波修復(fù)，行過氧化氫孵育及血清封閉。依次加入一抗、二抗進行孵育，行DAB顯色，蘇木素復(fù)染及乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

1.4結(jié)果判定 由醫(yī)院病理科兩名高年資病理科醫(yī)生采用雙盲方法進行判定，根據(jù)陽性細胞的染色程度及陽性細胞所占比例進行判定。陽性細胞染色程度可分成3類：0分為無明顯染色即為陰性，1分為胞核或胞質(zhì)呈現(xiàn)淡黃色染色為弱陽性，2分為胞核或胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色染色為陽性，3分為胞核或胞質(zhì)呈現(xiàn)黃褐色或黑色染色為強陽性。陽性細胞所占比可分為5類，0分為陽性細胞所占比例<5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。將染色程度評分與染色占比評分進行相乘，0～3分為陰性，4～12分為陽性(其中4～6分為中表達，7～9分為中表達，10～12分為高表達)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進行χ2檢驗、Fisher確切概率法及Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1FTC各臨床參數(shù)與MDM2及P53蛋白陽性率的關(guān)系 MDM2及P53蛋白陽性率與年齡、性別和是否遠處轉(zhuǎn)移無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，MDM2蛋白與P53在臨床腫瘤分期組及MDM2在腫瘤直徑組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2FTC和癌旁組織中MDM2和P53的表達情況 FTC組織和癌旁組織MDM2陽性率〔36例(64.29%)、23例(41.07%)；χ2=6.053,P=0.014〕及P53陽性率〔29例(51.79%)、18例(32.14%)〕差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.436，P=0.035)，見圖1。

2.3FTC中MDM2與P53表達的相關(guān)性 在FTC組中MDM2與P53共同表達陽性21例，陰性12例。MDM2表達陽性而P53陰性15例，P53表達陽性而MDM2陰性8例。兩者在FTC中呈正相關(guān)(rs=0.304，P=0.023)。

表1 FTC各臨床參數(shù)與MDM2及P53蛋白陽性率的關(guān)系〔n(%)〕

圖1 MDM2、P53在FTC、癌旁組織中的表達情況(免疫組化，×400)

3 討 論

MDM2基因也被稱為HDM2基因。作為E3連接酶的一種，其針對各種基物進行單基和聚泛素化，與P53腫瘤抑制因子相互作用，并建立了一個負反饋機制。P53和MDM2之間的平衡決定了細胞的生存率或腫瘤的發(fā)生〔4，5〕。 MDM2還通過激活野生型P53基因在腫瘤中的“休眠”，促使腫瘤細胞進行進一步的生長繁殖〔6〕。此外，MDM2能獨立于P53促進細胞增殖，目前已在脂肪肉瘤中被用做癌癥診斷生物標志物〔7〕。 Wade等〔8〕發(fā)現(xiàn)在EB病毒(EBV)感染的B細胞中，MDM2水平明顯高于正常細胞。 近年研究發(fā)現(xiàn)MDM2在乳腺癌、胃癌、骨肉瘤的表達增高〔9～11〕。本研究結(jié)果推測MDM2介導(dǎo)的泛素化途徑可能參與了FTC的發(fā)生發(fā)展，與之前的研究結(jié)果相符〔12〕，本研究結(jié)果反映了MDM2對腫瘤惡性程度的預(yù)測，雖然在本實驗中MDM2的表達情況與遠處轉(zhuǎn)移沒有相關(guān)性，但此結(jié)果可能與實驗樣本量相關(guān)，還有待進行進一步的驗證。

P53基因是目前廣泛研究的腫瘤抑制因子，P53突變體對腫瘤增殖、存活、無限復(fù)制、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等都起到積極作用〔13〕。近些年研究發(fā)現(xiàn)突變體P53的過表達對于結(jié)直腸癌干細胞的啟動很重要，其引起的大腸癌細胞Wnt和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB通路同時過度激活，是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要致癌機制之一〔14〕。有研究發(fā)現(xiàn)85%的膠質(zhì)母細胞瘤患者的發(fā)病與P53-ARF-MDM2通路被下調(diào)有關(guān)〔15〕。另外P53突變體不僅與各種腫瘤細胞的啟動過程有關(guān)，在轉(zhuǎn)移和侵襲的過程中也起到積極作用，Ahn等〔16〕發(fā)現(xiàn)突變體P53-R248能誘導(dǎo)卵巢癌細胞遷移和侵襲。Ghatak等〔17〕發(fā)現(xiàn)P53突變體通過促進NF-κB和抑制ASK1/c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號傳導(dǎo)來改變腫瘤壞死因子(TNF)-α下游信號傳導(dǎo)，利用免疫系統(tǒng)的炎癥作用促進腫瘤發(fā)展；且P53功能受損是由控制其水平的蛋白質(zhì)MDM2的過表達引起的。本研究結(jié)果與往期的研究結(jié)果一致，筆者推測P53參與了FTC的發(fā)生發(fā)展〔18〕。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)未分化型甲狀腺癌與P53-MDM2-P21WAF/CIP1通路有關(guān)，且通過其表達情況可以預(yù)測甲狀腺癌的惡性程度〔17〕。Swierniak等〔19〕研究中指出FTC的發(fā)生發(fā)展可能與P53-MDM2-CHEK2通路有關(guān)，筆者認為FTC的發(fā)生發(fā)展可能與P53和MDM2的過表達有關(guān)，且兩者在一條通路上。但對于二者在FTC中的作用機制仍存在爭議，還有待更多的實驗進行驗證〔12,19〕。MDM2催化不同底物形成的泛素化底物，一方面特異性抑制P53轉(zhuǎn)錄，引起P53的堆積，另一方面MDM2本身的過表達也會引起基因組的不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致FTC發(fā)生，并在其病情發(fā)展的過程中也起到一定積極作用。目前泛素化相關(guān)蛋白在甲狀腺癌領(lǐng)域研究較少，還需要更多研究來進行驗證。

綜上，MDM2與P53蛋白的聚集可能與FTC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制MDM2和P53的聚集，可能會成為FTC新的治療靶點，但二者作用的具體機制有待進一步研究證實。