環(huán)氧二十碳三烯酸對老年慢性心力衰竭大鼠的保護(hù)作用及機制

劉運陽 歐奇林 王素俠 劉陽

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421000)

慢性心力衰竭(CHF)是由于多種原因?qū)е滦氖夜δ芗敖Y(jié)構(gòu)異常引起的心室射血功能減少的臨床綜合征〔1〕，是多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)。CHF主要表現(xiàn)為心肌收縮功能和心輸出量下降，機體組織供氧和代謝的血液供應(yīng)減少〔2〕。CHF的發(fā)病率逐年上升，并且臨床預(yù)后差、死亡率高，5年死亡率與癌癥患者接近，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔3〕。環(huán)氧二十碳三烯酸(EETs)作為花生四烯酸經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝途徑的代謝產(chǎn)物，可擴(kuò)張血管及降低炎性反應(yīng)等，在高血壓、心肌缺血及肥胖等方面都起著重要的治療作用〔4〕。目前關(guān)于EETs對CHF的治療作用鮮有報告。本研究探討EETs對老年CHF大鼠的保護(hù)作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠60只，22～24周齡，雌雄各半，體重200～300 g，購自南華大學(xué)實驗動物部，生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2004-0009。實驗開始前先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，動物房溫度20～26℃，相對濕度45%～55%，晝夜時間12 h/12 h，用標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲用純凈水。

1.2藥品試劑及儀器 EETs由美國Cayman Chemical公司提供；注射用鹽酸阿霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號H33021980；白細(xì)胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α購自西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品上海有限公司；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒購自德國Roche公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白酶K購自德國Merck公司；磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)及磷酸化(p)-AKT、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體均購自美國Abcam 公司生產(chǎn)；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、兔抗鼠β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗大鼠IgG、電化學(xué)發(fā)光(ECL)Prime 蛋白印跡試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。主要儀器：Vevo 2100 超高分辨率小動物多普勒超聲影像系統(tǒng)購自加拿大Visualsonics 公司；-80℃超低溫冰箱購自青島海爾電冰箱有限公司；RM2245型石蠟切片機、ASP300S型全自動脫水機購自德國 Leica公司；BX53型顯微鏡購自日本Olympus公司；Thermo CL31R型離心機購自美國 Thermo 公司；Multiskan Spectrum 全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific 公司；Western印跡電泳儀購自美國Bio-Rad公司；Fluor Chem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)購自美國Alpha公司。

1.3CHF大鼠模型的制備 隨機選擇10只大鼠作為正常對照組，其余40只大鼠制備CHF模型。其方法如下：每只大鼠每周腹腔注射鹽酸阿霉素注射液4 mg/kg連續(xù)6 w，以10%水合氯醛(4.5 ml/kg)進(jìn)行麻醉，經(jīng)彩色多普勒超聲進(jìn)行左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)檢測，以LVEF≤ 60%判定為造模成功。正常對照組腹腔注射同體積生理鹽水，其他操作相同。40只造模成功的大鼠進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4分組及給藥 將40只造模成功的大鼠隨機分為模型對照組、EETs小劑量組、EETs中劑量組和EETs大劑量組各10只。EETs小、中、大劑量組分別每日腹腔注射EETs 10、20、40 μg/kg。正常對照組和模型對照組分別每日腹腔注射同體積生理鹽水。各組均連續(xù)給藥4 w。

1.5觀察指標(biāo) 治療4 w時檢測各組心功能、心臟質(zhì)量指數(shù)(HMI)和左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)、血清IL-6和TNF-α、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)及PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白。

1.5.1各組心功能測定 各組末次給藥2 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4.5 ml/kg)進(jìn)行麻醉后仰臥固定，胸前區(qū)剃毛，涂抹超聲耦合劑后進(jìn)行測量，取3個心動周期計算平均值。測量參數(shù)包括左室舒張期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮期內(nèi)徑(LVIDs)，計算左室舒張末期容量(LVEDV)和左室收縮末期容量(LVESV)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)和LVEF。

1.5.2各組心臟指標(biāo)(HMI和LVMI)檢測 各組大鼠處死后立即取出心臟，采用4℃的生理鹽水沖洗心臟殘血，用濾紙吸干水分，電子天平分別稱取全心質(zhì)量(THW)、左心室實際質(zhì)量(LVW)，計算HMI及LVMI，HMI=THW/BW，LVMI=LVW/BW。

1.5.3各組血清IL-6 和TNF-α測定 各組末次給藥心功能測定后腹腔靜脈采血約1 ml，室溫下靜止至血液完全凝固后離心(3 000 r/min×10 min)，取上清液采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定各組血清中 IL-6和TNF-α，測定時嚴(yán)格按照試劑盒說明書上所提供的方法及步驟操作。

1.5.4各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)測定 剪取各組大鼠左心室的1/2組織，置于4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)全自動脫水機脫水14 h，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片厚5 μm，常規(guī)脫蠟，用 0.3%過氧化氫溶液封閉30 min，再用20 mg/L 蛋白酶K消化心肌膜蛋白及核蛋白后，加入TUNEL反應(yīng)液，37 ℃孵育60 min；加入熒光素-5-異硫氰酸鹽(FITC)標(biāo)記抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片后用顯微鏡觀察。細(xì)胞凋亡判定標(biāo)準(zhǔn)：正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色。每只大鼠觀察3 張切片，每張切片隨機觀察5個高倍視野(×400)，每個視野計算凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計算AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，取其平均值。

1.5.5各組心肌細(xì)胞PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白測定 剪取各組左心室的剩余1/2組織，通過液氮研磨組織分離單細(xì)胞，后離心收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，于4℃離心(12 000 r/min×10 min)，分離得可溶性蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，于-20℃保存。進(jìn)行測量前先將蛋白室溫下解凍，100℃變性10 min。取10 μl上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠加載等量的蛋白溶液進(jìn)行電泳，然后用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)印。用5%脫脂奶粉(磷酸化抗體用4% BCA)封閉2 h，分別加入PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-actin一抗，4℃下孵育過夜。含吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3次，加入IgG-HRP，室溫避光孵育1 h，PBST洗膜3次。加 ECL 液曝光、顯影、定影。 用掃描儀掃描曝光膠片，用 Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗、配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組治療后心功能指標(biāo)比較 模型對照組LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV均較正常對照組顯著升高(P<0.05)，而FS和LVEF均較正常對照組顯著降低(P<0.05)。EETs小劑量組和模型對照組LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV、FS和LVEF差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；EETs中劑量組LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV均較模型對照組和EETs小劑量組顯著降低(P<0.05)，而FS和LVEF均較模型對照組和EETs小劑量組顯著升高(P<0.05)；EETs大劑量組LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著降低(P<0.05)，而FS和LVEF均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組治療后心臟指標(biāo)(HMI和LVMI)、心肌細(xì)胞AI及血清IL-6、TNF-α水平比較 模型對照組HMI、LVMI、心肌細(xì)胞AI及血清IL-6、TNF-α水平均較正常對照組顯著升高(均P<0.05)。EETs小劑量組和模型對照組HMI、LVMI、心肌細(xì)胞AI及血清IL-6、TNF-α水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；EETs中劑量組HMI、LVMI、心肌細(xì)胞AI及血清IL-6、TNF-α水平均較模型對照組和EETs小劑量組顯著降低(均P<0.05)；EETs大劑量組HMI、LVMI、心肌細(xì)胞AI及血清IL-6、TNF-α水平均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著降低(均P<0.05)。見表2。

表1 各組治療后心功能指標(biāo)比較

表2 各組治療后心臟指標(biāo)、心肌細(xì)胞AI及血清IL-6、TNF-α水平比較

2.3各組治療后心肌細(xì)胞PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白比較 模型對照組心肌細(xì)胞PI3K、p-AKT和Bax蛋白表達(dá)均較正常對照組顯著升高(均P<0.05)，而AKT、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)均較正常對照組顯著降低(均P<0.05)。EETs小劑量組和模型對照組PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；EETs中劑量組心肌細(xì)胞PI3K、p-AKT和Bax蛋白均較模型對照組和EETs小劑量組顯著降低(均P<0.05)，而AKT、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)均較模型對照組和EETs小劑量組顯著升高(均P<0.05)；EETs大劑量組心肌細(xì)胞PI3K、p-AKT和Bax蛋白均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著降低(均P<0.05)，而AKT、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組治療后PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白比較

3 討 論

CHF時由于心臟的損害或超負(fù)荷而導(dǎo)致的心臟工作效率降低，直接的表現(xiàn)就是心臟功能發(fā)生障礙。隨著人口老齡化和生活方式的改變，CHF患病人數(shù)不斷增加，據(jù)估算目前全球有超過3 800萬例心衰患者〔5〕。因為CHF需要長期治療，并且病情反復(fù)，因此產(chǎn)生巨額的醫(yī)療費用，成為日益嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題。EETs是花生四烯酸經(jīng)細(xì)胞色素 P450 表氧化酶的代謝產(chǎn)物，在炎癥、心血管功能和血管生成方面發(fā)揮著重要作用。EETs在脈管系統(tǒng)通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的激活具有明顯的抗炎作用〔6〕。在心血管系統(tǒng)EETs可松弛血管平滑肌細(xì)胞，通過激活鈣激活K+通道提供心肌保護(hù)，還可增加內(nèi)皮型一氧化氮合成酶的表達(dá)和活性從而降低動脈血壓〔7〕。EETs通過環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶(PK)A介導(dǎo)的信號通路增加環(huán)氧酶-2的表達(dá)促進(jìn)血管生成〔8〕。EETs通過PI3K/AKT信號的激活和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)脫磷酸作用等機制抑制細(xì)胞凋亡〔9〕。本研究說明EETs可改善老年CHF大鼠的心功能。HMI和LVMI是分別是左心室腫瘤與心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，間接反映心臟的左心室功能，而EETs可劑量依賴性降低CHF大鼠HMI和LVMI。

細(xì)胞凋亡是一種基因程序化的、活躍的細(xì)胞自殺過程，在體內(nèi)平衡和清除不需要的細(xì)胞方面起著至關(guān)重要的作用。CHF發(fā)病機制尚不明確，而心肌細(xì)胞凋亡在CHF 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，會導(dǎo)致心肌收縮功能下降，使 CHF發(fā)生進(jìn)行性惡化〔10，11〕。因此，阻斷心肌細(xì)胞凋亡可降低CHF發(fā)病率，延緩CHF發(fā)展，改善心臟各項功能〔12〕。本研究結(jié)果說明EETs可抑制CHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

心肌細(xì)胞對缺血、缺氧非常敏感，在缺血或缺氧的情況下，炎性因子增多、脂質(zhì)過氧化水平增加、細(xì)胞膜的穩(wěn)定性及完整性被破壞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡〔13〕。IL-6和TNF-α是由單核-巨噬細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，是參與HF病理過程的細(xì)胞因子〔14〕。IL-6 主要由單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，可直接或者間接參與炎性細(xì)胞的活化，參與左心室重構(gòu)和心肌纖維化過程從而使其功能失調(diào)，加重HF過程中心肌缺血缺氧等炎性損傷反應(yīng)〔15〕。TNF-α 為抗腫瘤活性細(xì)胞因子，當(dāng)患者出現(xiàn)HF時，其血流動力學(xué)異常，左心室舒張末期壓力升高，導(dǎo)致心肌細(xì)胞受到牽張刺激而產(chǎn)生TNF-α〔16〕。TNF-α可通過負(fù)性肌力作用，誘導(dǎo)心室重構(gòu)，并且對部分原癌基因有激活作用而促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果說明EETs可能通過降低CHF大鼠血清IL-6和TNF-α水平而降低機體炎癥反應(yīng)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡途徑包括死亡受體途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑等，PI3K/AKT信號通路被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)最重要的生存通路〔17〕，在促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡中發(fā)揮重要作用，并且與CHF的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔18〕。PI3K作為該信號通路的起始因子，各種生長因子作用于膜受體而使PI3K激活而產(chǎn)生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3與AKT結(jié)合，使 AKT 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，使AKT磷酸化而被活化〔19〕。過度活化的AKT可直接磷酸化前凋亡基因Bax，激活抗凋亡蛋白Bcl-2，而Bax表達(dá)的增加可使線粒體膜對細(xì)胞色素 C 的通透性增加，由線粒體進(jìn)入胞質(zhì)的細(xì)胞色素 C 能夠啟動 Caspase級聯(lián)反應(yīng)并最終激活 Caspase-3執(zhí)行細(xì)胞凋亡過程〔20〕。本研究結(jié)果說明EETs可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路蛋白的表達(dá)而抑制CHF大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。

綜上，EETs對老年CHF大鼠心功能具有改善作用，其作用可能與其抑制心肌細(xì)胞凋亡、降低機體炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)PI3K/ AKT 信號通路蛋白的表達(dá)有關(guān)。