沉默ASGPR基因對附子多糖靶向抗肝癌作用的影響

孫金霞 馬桂芳 史衛紅 黃思怡 楊李 李啟松 吳芹

(江蘇醫藥職業學院，江蘇 鹽城 224005)

肝細胞癌(HCC)致死率在腫瘤中居第三位，僅次于肺癌和胃癌〔1〕。目前針對HCC的治療尚無有效辦法，無論靶向藥物或傳統化療方案均無法為HCC患者帶來滿意的治療效果。附子作為“百藥之長”，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛之功效。研究發現，附子對腫瘤細胞SGC-7901具有抑制生長的作用〔2〕。研究發現，附子總生物堿能有效緩解小鼠誘導出現的乳腺癌身體冰冷、血塊淤積等癥狀〔3〕。董蘭鳳等〔4〕發現，將附子多糖和阿霉素連用，能誘導腫瘤細胞凋亡，且連用能有效激活特異性T細胞免疫，從而起到抗腫瘤的效果。附子中主要化學成分有生物堿、多糖、苷類等〔5，6〕。附子多糖抗腫瘤作用日益被重視，主要成分是葡萄糖，另含有半乳糖、甘露糖等〔7〕，目前國內對附子多糖抗HCC作用及機制進行了初步研究〔8，9〕。本研究旨在探討沉默去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)基因對附子多糖靶向治療HCC的機制。

1 材料與方法

1.1細胞株與培養 293T細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，HepG2細胞購自美國ATCC公司。HepG2細胞和293T細胞均使用DMEM培養基(均含10%胎牛血清、100 U/ml雙抗)，培養條件為37℃、5%CO2細胞培養箱。

1.2動物與分組 24只雄性SPF級Balb/c裸鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司，飼養于江蘇醫藥職業學院實驗動物中心；建立HCC模型后將動物按照體重隨機分為4組：HepG2-NC siRNA+生理鹽水(A組)，HepG2-ASGPR siRNA+生理鹽水(B組)，HepG2-NC siRNA+附子多糖(C組)，HepG2-ASGPR siRNA+附子多糖(D組)，每組6只。

1.3附子多糖 采用文獻〔7〕方法提取附子多糖。用于動物灌胃給藥時，附子多糖采用研磨法生理鹽水混懸使用；用于細胞實驗時，附子多糖粉末用磷酸鹽緩沖液(PBS)或無血清培養基配制成相應濃度的多糖溶液，細胞培養時使用0.22 μm無菌濾器過濾即可。

1.4試劑與儀器 慢病毒載體(GFP標簽)購自蘇州瑞昊生物技術有限公司，靶向沉默ASGPR的RNA干擾序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成〔10〕。RPMI1640、DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，限制性內切酶和連接酶均購自日本TaKaRa公司，質粒抽提試劑盒購自美國Axygen公司，β-actin和ASGPR抗體購自美國Santa Cruz公司，CCK-8試劑盒、真核細胞蛋白提取試劑盒、抗體稀釋液、聚偏氟乙烯(PVDF)/NC膜、ECL顯影試劑和二抗等均購自碧云天生物技術公司，超凈工作臺購自蘇凈公司，CO2培養箱購自三洋公司，流式細胞儀購自美國BD公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，Western印跡電轉設備購自美國伯樂公司。

1.5方法

1.5.1重組慢病毒干擾載體與病毒制備 以RNAi序列為正義鏈，以其互補鏈為反義鏈，分別在正、反義鏈之間加入Loop(UUCAAGAGA)，同時在正義鏈5′端和反義鏈3′端加入不同酶切位點，從而形成siRNA發夾結構shRNA，將該shRNA序列及其互補序列利用連接酶與慢病毒載體進行基因重組，重組載體記為lenti-ASGPR siRNA組；陰性對照RNAi序列處理相同，記為lenti-NC siRNA組。使用質粒提取試劑盒制備重組慢病毒質粒，然后使用293T細胞進行慢病毒包裝，12 h后更換新鮮培養基，繼續培養48 h后，使用熒光顯微鏡觀察熒光強度和細胞生長狀態，收集病毒上清，-80℃凍存備用。

1.5.2HepG2細胞穩定沉默ASGPR細胞株 獲得與鑒定慢病毒顆粒感染HepG2細胞，然后經流式細胞儀分選綠色熒光蛋白(GFP)陽性的細胞，擴大培養，流式細胞儀分析細胞GFP表達的陽性率，以確定是否穩定轉染。然后提取細胞總蛋白，Western印跡檢測ASGPR表達量，利用抗ASGPR2抗體(1∶1 000)進行一抗孵育，辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔IgG二抗(1∶200)孵育，以確定ASGPR的表達是否成功被沉默。

1.5.3體外細胞增殖實驗 分別收集對數期HepG2-NC siRNA和HepG2-ASGPR siRNA細胞，取少許進行臺盼藍計數，確定活細胞比例，確定生長良好后調節細胞懸液濃度按每孔加3×103個/100 μl細胞鋪至96孔板，各設3個復孔，按照50 μg/ml添加附子多糖，置于37℃，5%CO2孵育48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續培養3 h。酶聯免疫檢測儀測定OD450 nm時，各孔的吸光度值。

1.5.4裸鼠HCC原位移植瘤模型的建立 按照文獻〔11〕方法，取對數生長期HepG2-ASGPR siRNA和HepG2-NC siRNA細胞，分別用PBS制成單細胞懸液，濃度為5×105/ml，每只小鼠注射的細胞量為1×106/2 ml PBS，利用高壓水流動力學的注射方法在5～8 s內將細胞通過尾靜脈注射到小鼠體內，注射后次日開始給予附子多糖(500 mg/kg)。4 w后處死小鼠，取出小鼠肝臟，計數肝臟腫瘤結節數并稱重。

1.6統計學方法 采用GraphPad prism5.0軟件進行方差分析、t檢驗，流式細胞儀分析結果使用FlowJo7.6 軟件處理作圖。

2 結 果

2.1慢病毒包裝GFP陽性細胞 視野下細胞均表達熒光強烈，且細胞生長良好，見圖1，說明病毒包裝成功，收集病毒上清并用0.22 μm的無菌濾器過濾，用于HepG2細胞感染。

2.2HepG2不同轉染組細胞中GFP和ASGPR的表達情況 lenti-NC siRNA組和lenti-ASGPR siRNA組HepG2細胞均成功表達GFP，轉染效率高達99%以上。A組ASGPR蛋白表達水平(0.989±0.008)顯著高于B組(0.473±0.011，P<0.001)。見圖2。

圖1 293T細胞包裝慢病毒后的細胞熒光(×100)

圖2 Western印跡檢測AGSPR2水平

2.3RNA干擾ASGPR表達后，附子多糖對肝癌細胞體外增殖的影響 A組與B組細胞株增殖無明顯差異(P>0.05)。C組OD450值顯著低于A組， D組OD450值顯著低于B組(P<0.05)，表明附子多糖對可顯著抑制肝癌細胞的體外增殖。D組細胞的OD450值顯著高于C組細胞的OD450值(P<0.05)，表明ASGPR表達的缺失，使附子多糖的體外抑制肝癌細胞增殖的能力下降，推測ASGPR可能在附子多糖抗肝癌細胞增殖中發揮作用。見表1。

2.4RNA干擾ASGPR表達后，附子多糖對裸鼠肝癌成瘤的影響 利用高壓水流動力學建立肝癌原位移植瘤模型，見表1和圖3，模型建立成功。C組與A組相比， D組與B組相比，在腫瘤結節數、肝臟重量顯著下降(P<0.05)，表明附子多糖可顯著抑制裸鼠肝癌成瘤。而D組腫瘤結節個數和肝臟重量顯著高于C組(P<0.05)，表明干擾ASGPR表達后，附子多糖的體內抑癌能力下降，該結果與體外抑瘤趨勢一致，充分表明ASGPR在附子多糖抗肝癌中的重要作用。

表1 各組OD450、腫瘤結節數、肝臟重量比較

圖3 附子多糖對各組HCC的影響

3 討 論

溫陽散寒中藥對許多晚期癌癥患者出現的陽虛寒凝臨床表現有較好療效。附子來源于毛茛科多年生草本植物烏頭，有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效，臨床用于治療各種亡陽癥、虛寒癥、寒痹癥等。附子多糖是附子的多糖類成分，是附子發揮作用的主要成分之一。

肝細胞表面存在多種糖鏈識別受體,如甘露糖受體、半乳糖受體等〔12〕。ASGPR是一種跨膜蛋白，是主要表達在肝竇狀隙和基底外側細胞表面的受體。人肝癌細胞系HepG2能高表達ASGPR，其表達的ASGPR約為22.5萬個〔13〕，是研究ASGPR的理想細胞。ASGPR的胞外結構域含有糖識別結構域,能識別和結合半乳糖殘基和 N-乙酰半乳糖胺殘基,當與特異的糖殘基結合后,即發生受體介導的胞吞作用〔14，15〕。有研究發現當歸多糖可靶向肝臟富集,且可能通過 ASGPR 介導進入肝臟細胞〔16〕，從而影響肝癌細胞的生物學功能。