p38MAPK信號通路誘發糖尿病腎病的研究進展

盧奇奇 余超 汪志平

(浙江大學原子核農業科學研究所 農業農村部核農學重點開放實驗室，浙江 杭州 310058)

據世界衛生組織預測，2025年全球糖尿病患者將增至3億人，其中75%將分布在中國、印度等發展中國家。糖尿病腎病(DN)作為糖尿病的最常見并發癥，已成為引起老年人慢性腎衰竭的重要病因之一〔1，2〕。DN占終末期腎衰竭患者的比例在美國居第一位、在歐洲居第二位，在我國也已上升至15%〔1～3〕。DN病理上表現為細胞外基質(ECM)積聚、基底膜增厚、腎小球肥大和硬化、腎間質纖維化等。DN的發病機制十分復雜，至今尚未能全面解析，但眾多研究與臨床實踐已表明，持續高血糖狀態引起的代謝紊亂是DN發生的最主要誘因〔1，3〕。DN的發生涉及多樣而復雜的細胞信號通路系統，如p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號轉導通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、Wnt/β-連環蛋白、轉化生長因子β/Smad蛋白(TGF-β/Smad)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶β(PI3K/Akt)信號通路等。控制血糖是預防與治療DN的基礎〔1，2〕。桑葉、絞股藍、黃芪、人參、地骨皮、黃連等中草藥具有良好的降血糖功效〔4〕，且在控制血糖方面表現出多功能、多靶點、低毒副作用、安全可靠、作用溫和持久等獨特優勢，能有效減緩DN的發生〔5〕。本文綜述了基于p38MAPK信號通路介導DN發生的細胞分子生物學機制，并概述了20余味中草藥通過干預p38MAPK信號通路減緩DN發生的研究進展。

1 p38MAPK信號轉導通路

1.1p38MAPK信號通路 MAPK是一系列絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，主要包括p38MAPK、細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)、應激活化蛋白激酶(SAPK)。MAPK信號通路的基本組成是經典的三級酶促級聯反應，包括促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKK)和MAPK，這3種激酶能依次激活，使靶蛋白磷酸化并活化，激活下游信號通路，共同調節著細胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應等多種重要的生理病理過程〔6〕。

p38MAPK是MAPKs家族的重要成員，由Brewster等〔7〕于1993年首次發現。p38由360個氨基酸殘基組成，分子量為38 kD〔8〕。p38有α、β、γ、δ 4種亞型，其中p38α和p38β又各含2種異構體。Goedert等〔9〕發現p38α幾乎分布于所有的細胞和組織；p38β主要分布于大腦；p38γ主要分布于骨骼肌；p38δ主要分布于內分泌腺；組織表達特異性及其結構的差異性決定了不同亞型的p38擁有不同的結合底物。p38MAPK在腎臟細胞的分布情況研究中，Sakai等〔10〕發現其分布在腎小管的上皮細胞、系膜細胞、內皮細胞和足細胞中。Omori等〔11〕研究發現p38MAPK在腎臟發育早期呈高表達，而在腎臟發育成熟期表達顯著減少，早期時p38MAPK主要在輸尿管芽細胞與腎臟芽細胞中豐富表達，腎小球中表達微弱。成熟期時其僅在腎小球臟層上皮、集合管和遠端腎小管表達。

1.2p38MAPK信號通路的活化 高血糖、晚期糖基化終產物(AGEs)、活性氧(ROS)、炎癥因子、細胞張力、TGF-β1、血管緊張素Ⅱ、內皮素-1等多種外界刺激因子可以刺激p38MAPK的活化。p38MAPK的激活也是經典的三級酶促級聯反應，MAPK活化后，催化MAPK活化環內的兩個蘇氨酸或絲氨酸磷酸化，隨即MAPK催化靶向MAPK保守區T-X-Y模塊內的酪氨酸和蘇氨酸殘基同時磷酸化，最后MAPK將下游底物如磷脂酶A2、細胞周期素D1、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物、轉錄因子、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白，p53和肌細胞增強因子2A等磷酸化〔12，13〕，激活相關信號通路，將細胞外刺激信號傳遞至細胞核，影響細胞的生長、分化、凋亡等〔14〕。

2 p38MAPK信號通路與DN

p38MAPK在DN發生發展過程中起著重要作用，通過激活不同下游因子影響著腎細胞的功能，主要有促進炎癥因子的產生，介導炎癥反應的發生，引起腎組織炎癥損傷；調節基因的表達來促進CECM合成或者抑制ECM降解，導致腎系基底膜增厚，腎間質纖維化；調控細胞周期蛋白的表達以促進細胞增殖，引起腎體積肥大，腎小球硬化等〔6〕。

2.1p38MAPK影響核因子(NF)-κB 炎癥是導致DN的重要機制，p38MAPK信號通路是DN發病機制中參與并激活巨噬細胞，發動組織炎癥反應的重要途徑〔15〕。DN發生時有大量的炎性細胞如巨噬細胞、單核細胞等和促炎細胞因子如白細胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ等產生，Eizirik等〔16〕認為這些炎性細胞和促炎細胞因子在p38MAPK-NF-κB介導的促炎癥反應和細胞凋亡途徑中作用顯著。

NF-κB是許多信號通路和基因表達途徑的轉錄因子。NF-κB家族蛋白可分為RelA、RelB、C-Rel、P52和P50五種，主要以二聚體形式存在，其中P52和P50各自的二聚體作為一種抑制分子，在細胞內一般各自以P100、P105的前體形式存在〔15〕。NF-κB發揮生物學活性的主要種類是RelA、P50。一般情況下，NF-κB存在于細胞質中，與其抑制蛋白(I-κB)結合并以三聚體形式存在，呈現不活躍狀態。NF-κB家族主要參與促使炎癥細胞因子的產生、激活細胞炎癥反應的發生，從而引起腎小球損傷并硬化等〔17〕。

如圖1通路1所示，高血糖、AGEs、ROS、細胞因子等外界因素可以刺激p38MAPK的活化。活化的p38MAPK激活NF-κB二聚體，然后NF-κB易位進入細胞核，與DNA上的κB位點結合，轉錄酶啟動基因表達程序，調節炎性因子的表達〔18〕。NF-κB會上調炎癥因子如IFN-γ誘導蛋白(IP)-10和IL-15等的表達，并將單核-巨噬細胞等吸引到炎癥部位誘發組織炎癥。張曉雪等〔19〕研究發現高血糖可以促進p38MAPK磷酸化，進而促進腎小球內皮細胞表達并分泌 IL-6 、TNF-α，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)顯示，與對照組相比，20.0 mmol/L及40.0 mmol/L高糖組的腎小球內皮細胞分泌的炎性因子 IL-6 及TNF-α顯著增加(均P<0.05)，且40.0 mmol/L 高糖組效果更顯著。余學清等〔20〕發現采用脂多糖(LPS) 可以刺激腎系膜細胞 p38MAPK的磷酸化，p38MAPK 在被LPS刺激 5 min 后活性逐漸升高，30 min達到活性高峰，且炎癥因子IL-1β 在 3 h 后 的mRNA及蛋白表達水平顯著升高。p38MAPK-NF-κB途徑會產生大量炎癥因子損壞腎組織，同時這些炎癥因子又反激活p38MAPK，再一次促進炎癥途徑的發生以產生大量炎癥因子，使炎癥信號不斷被放大、積累，惡性循環地加重腎組織炎癥損傷〔21〕。

炎癥引起DN的過程中，除了炎性因子IL-6 及TNF-α等作用外，單核細胞趨化蛋白(MCP)-1和骨橋蛋白(OPN)也起到了不可忽視的作用，這兩種介質主要通過誘導單核-巨噬細胞浸潤腎組織，促進炎癥的發生。張寧〔22〕研究發現，p38MAPK-NF-κB通路可以直接上調OPN mRNA 、MCP-1 mRNA 的轉錄表達，進而促進炎癥反應擴散。此外，p38MAPK誘導NF-κB進入細胞核后，還可以促使誘導型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表達，促進一氧化氮(NO)的生成，導致細胞損傷甚至凋亡〔23〕。

2.2p38MAPK與TGF-β1 DN發生過程中的另一個顯著特征是ECM蛋白如膠原蛋白和纖維連接蛋白(FN)等的形成。高血糖等因素可以刺激腎小球系膜基質中FN和膠原蛋白在系膜和腎小管間質中的過度生成與積累，這會導致上皮細胞向成纖維細胞轉變，最終細胞纖維化〔24〕。TGF-β1參與調控ECM合成〔25，26〕，促進腎小球硬化和腎間質纖維化，從而加速糖尿病進程，大量的體外研究表明TGF-β1是最強的促纖維化關鍵細胞因子。哺乳動物中TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型，其中TGF-β1最為常見，且在腎間質纖維化中具有重要作用。TGF-β1誘導FN、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原等ECM的合成，同時抑制其降解，是誘導腎間質纖維化發生的重要原因之一。

Jiang等〔27〕已證實TGF-β1是p38MAPK的上游調節因子。一般情況下，TGF-β1 蛋白N端的二聚體潛在相關肽(LAP)以非共價形式與C端的二聚體成熟型TGF-β1相連，再與TGF-β1 結合蛋白(LTBP)相結合并以非活性狀態存在。當受到高糖、氧化應激等刺激時，TGF-β1經蛋白酶切去N-末端的相關肽，復合物瓦解并釋放具有生物活性的TGF-β1〔28〕，活化的TGF-β1與受體TβRⅠ、TβRⅡ型結合形成TβRⅡ-TGF-β1-TβRⅠ三聚體復合物，進而發揮生物活性。在建立的DN小鼠模型中，發現血糖值與TGF-β1呈正相關關系〔29〕。一方面，如圖1通路2所示，由高血糖、氧化應激激活的TGF-β1-p38MAPK信號通路可進一步上調FN的表達〔30，31〕。在FN基因啟動子的核苷酸位置-170處有一個磷酸化環腺苷單磷酸反應元件(CRE)調控元件，被TGF-β1激活的p38MAPK CRE結合蛋白(CREB)〔32，33〕，磷酸化的CREB再進入細胞核與CRE相互作用，增強FN mRNA的表達，最終導致系膜細胞產生大量FN，FN是ECM的重要組成部分，主要位于腎小球系膜基質、腎小球基底膜及其與腎小球細胞的連接處，FN的增加會引起腎系基底膜的增厚，使腎小球硬化，嚴重則會導致腎間質纖維化，加速DN發展。p38MAPK 與TGF-β1的作用是相互的，TGF-β1可以激活p38MAPK發揮其作用，p38MAPK也可以影響TGF-β1的生成，進一步影響DN的進程〔34〕。另一方面，活化的TGF-β1通過激活p38MAPK信號通路〔28〕，還能引起下游NF-κB活化，調節基因表達，促使大量炎癥因子的生成，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等，造成腎臟足細胞損傷與凋亡。

2.3p38MAPK影響早期生長反應蛋白(Egr)1 腎小球系膜細胞是腎臟細胞中的主要類型之一，高糖、血管緊張素Ⅱ和細胞因子等因素可以刺激系膜細胞的增殖。系膜細胞增殖是DN發生早期病理生理機制的重要誘因，最終會導致患者機體慢性腎衰竭〔35〕。因此，抑制系膜細胞增殖被認為是預防和改善DN的途徑之一。

Egr1是屬于鋅指家族的轉錄因子，參與了多種重要的病理生理基因的激活〔36〕。Egr1在高糖誘導的系膜細胞增殖、腎纖維化及腎小球硬化中起關鍵作用〔37，38〕。Egr1表達受p38MAPK的激活調控〔36，39〕。

如圖1通路3所示，溶血磷脂酸(LPA)可通過激活p38MAPK增加系膜細胞中Egr1的表達，活化的Egr1隨即進入細胞核與細胞增殖相關的啟動子Kruppel樣因子(KLF)5上的專一位點結合〔36，40〕。KLF5可以直接調控p27Kip1 mRNA水平〔41，42〕，p27Kip1為細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子，在調控細胞周期中具有重要作用。Liu等〔43〕發現在高糖刺激的DN大鼠模型的系膜細胞中檢測到p27Kip1表達下調。此外經過增強p27Kip1表達的藥物處理的系膜細胞中表現出較強的抗增殖活性〔44，45〕。正常生理狀態下，周期蛋白(Cyclin)D1-細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4復合物往往與p27Kip1緊密結合，處于非活性狀態，抑制細胞的分裂與增殖〔46，47〕。CyclinD1與CDK4參與了G1/S期細胞增殖的調控機制，它們的過度表達會促進細胞的分裂與增殖〔48〕。Kim等〔40〕研究發現，經LPA處理的DN小鼠系膜細胞和腎臟皮質中KLF5 mRNA及其蛋白表達水平均升高；KLF5表達下調可增加p27Kip1的表達，進而抑制LPA引起的系膜細胞增殖作用；KLF5可直接降低p27Kip1的表達，上調CyclinD1與CDK4的表達，進而導致系膜細胞過度增殖，腎小球硬化，加速DN病理進程。

MMP：基質金屬蛋白酶；TIMP：MMP組織抑制劑圖1 p38MAPK介導的DN發生的信號通路及相關中草藥活性成分的作用位點

2.4p38MAPK影響MMPs MMPs是一類Mg2+、Zn2+依賴蛋白，屬于肽鏈內切酶家族。MMPs往往由5個不同的結構域組成，即疏水信號肽序列、前肽區、催化活性區、富含脯氨酸的鉸鏈區與羧基末端區〔49〕。目前已鑒別出的MMPs有20余種，并根據其底物特異性分為六類，即膠原酶、明膠酶、基質降解素、間質降解素、膜型基質、其他MMPs。MMPs主要參與腎細胞ECM降解、轉運，在正常生理狀態下，它能與其內源性TIMPs調節腎細胞ECM合成與降解的動態平衡，從而保護腎細胞并維持其正常功能〔50〕。

研究表明，某些類型MMPs的活性受p38MAPK調節。聶春巖〔51〕發現在高糖誘導的DN小鼠模型中，其系膜細胞p38MAPK與TIMP-2 mRNA及蛋白表達水平升高，而MMP-2 mRNA及其蛋白表達水平降低，且MMP-2/TIMP-2比值減小，與高糖濃度變化呈一定的依賴性，通過添加p38MAPK抑制劑SB203580可以逆轉MMP-2、TIMP-2 mRNA及其蛋白表達水平；郭娟娟〔52〕發現高糖可以誘導DN小鼠p38MAPK信號通路活化，從而使系膜細胞表達MMP-9與TIMP-1 mRNA平衡改變，MMP-9/TIMP-1比值減小，減少腎細胞ECM的降解，引起ECM大量聚集，加速DN進程。

3 基于p38MAPK活性調控減緩DN發生的主要中草藥

近年來，越來越多的研究發現，一些中草藥對p38MAPK活性具有顯著的抑制作用，并可有效降低甚至阻止DN的發生。見圖1。

黃酮類物質中，金銀花提取物的綠原酸及金柚提取物的黃酮類化合物能通過抑制p38MAPK介導的炎癥反應途徑，減少腎組織中巨噬細胞表達，降低炎癥因子表達，從而阻止DN發展〔53，54〕；洋蔥、橙子、歐芹等中的芹黃素，可通過抑制p38MAPK-NF-κB-TNF-α和TGF-β1-p38MAPK-CREB通路，減少細胞凋亡、腎組織炎癥和纖維化，從而減輕DN癥狀〔55〕；黃芩中的黃芩素可通過抑制p38MAPK 磷酸化、氧化-硝化應激等途徑，抑制DN發生及惡化〔56〕；葛根中的葛根素可通過降低 TGF-β1的表達抑制p38MAPK活性，進而抑制DN〔57〕。

生物堿類物質中，蛹蟲草、冬蟲夏草中的蟲草素，能抑制高糖介導的 p38MAPK 的磷酸化及 TGF-β1 的表達，減輕腎組織纖維化癥狀〔58〕；川芎、溫莪術等中的川芎嗪，可抑制p38MAPK、ERK1/2磷酸化，減少炎癥因子，減輕DN癥狀〔59〕。

多糖類物質中，黃芪多糖可通過抑制p38MAPK-NF-κB通路，減少細胞凋亡、腎組織炎癥和纖維化，從而減輕DN癥狀〔60〕；枸杞多糖可抑制p38MAPK信號通路，減輕DN癥狀〔61〕；山藥多糖可下調高糖激活的p38MAPK-CREB信號通路，減少腎ECM積聚，減輕腎臟纖維化程度，保護腎功能〔62〕。

酚酸類物質中，雷公藤和南蛇藤中的雷公藤紅素，可通過抑制p38MAPK-NF-κB通路，減少炎癥因子的產生，減輕DN癥狀〔63〕；五倍子、漆樹、茶等中的沒食子酸，可抑制p38MAPK磷酸化，降低DN的發生進程〔64〕。多酚類物質中，花生、葡萄、虎杖、桑椹中的白藜蘆醇，可通過抑制p38MAPK磷酸化，減少 TGF-β1的表達來減少腎纖維化〔65〕。

此外，蒽醌類物質中，虎杖中的大黃素，可通過與p38MAPK結合抑制其活性，減緩DN進程〔66〕。核桃中所含的蒽醌類等物質，具有顯著的降血糖作用，能有效防止DN發生或減緩病變進程〔67，68〕。