Hh信號通路相關因子Shh、Ptch-1和Gli-1在前列腺癌中的表達及意義

張 航，張建坤

(河北中石油中心醫(yī)院泌尿外科，河北 廊坊 065000)

前列腺癌是歐美發(fā)達國家男性最常見的惡性腫瘤[1]，隨著人口老齡化推進、生活方式西方化與臨床診斷技術的不斷進步，我國前列腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[2]。前列腺癌的發(fā)生與基因遺傳有密切關聯(lián)，其中刺猬信號通路(hedgehog,Hh)信號通路與前列腺癌的關系近年來成為國內外關注的焦點。有研究表明，Hh信號通路在前列腺發(fā)育過程中起到重要的調控作用，該通路發(fā)生異常時可誘發(fā)腦、肺、胃腸等組織產生惡性腫瘤，因此有針對性的阻斷該通路能夠有效抑制腫瘤的發(fā)生[3]。國外文獻更是直接指出了Hh通路與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展有密切關聯(lián)[4-6]，但Hh信號通路誘發(fā)前列腺癌的具體機制尚不明確。因此，探究Hh信號通路中各相關因子的分子機制與作用對前列腺癌的醫(yī)學研究具有重大意義。本研究旨在檢測Sonic刺猬信號通路(sonic hedgehog，Shh)、Patched-1(Ptch-1)、腦膠質瘤相關癌基因1(glioma related oncogene homology-1，Gli-1)在前列腺癌組織中的表達情況，分析其與前列腺癌臨床分期、分化程度、血清PSA的關系，探討其在前列腺癌發(fā)生與進展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年8月—2020年5月我院前列腺疾病防治中心獲取的97例行前列腺穿刺或根治性前列腺切除術患者組織新鮮標本，保存于液氮罐內，術后病理學檢查證實前列腺腺癌60例，所有患者接受穿刺術前均未接受放化療等相關治療。并選取癌旁前列腺正常組織標本作為對照組，分離獲取的癌旁組織為癌灶周圍的正常前列腺組織，分離時注意不能沾染到癌灶區(qū)域。其中年齡54～83歲，平均(75.24±2.63)歲；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期39例；分化程度：高分化5例，中分化23例，低分化32例；PSA<4 μg/L 5例，4～10 μg/L 8例，>10 μg/L 47例。

1.2主要儀器與試劑 PSA酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(瑞典CanAg)；兔抗人Shh抗體(美國abcam，編號ab53281)；兔抗人Ptch-l抗體(美國abcam，編號ab39266)；兔抗人Gli-l抗體(美國abcam，編號ab41782)；PV-9000二步法免疫組織化學廣譜檢測試劑盒(美國GBI)；組織切片機(德國Leica，RM2245型)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，DNP-9162BS-Ⅲ型)；光學顯微鏡(日本OLYMPUS，BX-51型)；圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS，BX-4型)；反轉錄試劑盒(Takara，批號：CS1247)；Real-time PCR擴增儀(Bio-Rad，CFX96型)。

1.3實驗方法

1.3.1檢測血清PSA含量 采集患者血清樣本，通過ELISA法檢測血清PSA含量，嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行各項操作。

1.3.2免疫組織化學檢測Shh、Ptch-1、Gli-1陽性表達情況 將獲取的標本采用10%中性甲醛固定，石蠟包埋、透明、梯度脫水、切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色觀察標本組織學特點，并進行Gleason評分。采用PV-9000二步法免疫組織化學廣譜檢測試劑盒進行免疫組織化學染色。①將石蠟切片置于70 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內烘烤1 h，取出后放入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min進行脫蠟，酒精梯度入水(100%、95%、80%，各5～10 min)，蒸餾水洗1 min，PBS沖洗3次，3 min/次；②切片放入枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)內煮沸20 s，室溫自然冷卻，取出玻片，蒸餾水、PBS各沖洗2次，3 min/次；③根據(jù)一抗要求處理切片；④3%H2O2孵育10 min；⑤PBS沖洗3次，2 min/次；⑥加入一抗，37 ℃孵育1～2 h，PBS沖洗3次，2 min/次；⑦加入二抗覆蓋組織，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，2 min/次；⑧加入新配置的DAB顯色液；⑨自來水沖洗、復染、脫水、透明、封片。

1.3.3檢測Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達情況 取50～100 mg新鮮標本，加入Trizol制備成勻漿，按照逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)說明書提取總RNA，在OD260、OD280處采用紫外光分光光度計檢測總RNA，樣品OD260/OD280比值在1.8～2.0表示提取成功。根據(jù)試劑盒說明書建立逆轉錄體系獲取cDNA，采用Premier Primer5軟件設計引物序列，并按試劑盒說明書進行PCR擴增，94 ℃預變性2 min，96 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，循環(huán)30次，引物序列與反應條件見表1。PCR擴增結束取10 μL目的基因與β-actin產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并通過軟件進行灰度分析得出Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4檢查結果判斷標準

1.4.1臨床分期 T0：未找到原發(fā)腫瘤證據(jù)；T1：病理檢查提示有癌，但臨床檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤；T2：腫瘤僅出現(xiàn)在前列腺內；T3：腫瘤穿透前列腺包膜；T4：腫瘤侵犯前列腺周圍組織并與之固定。

1.4.2分化程度 采用Gleason分級系統(tǒng)對前列腺癌組織進行分級，采取5級10分制。前列腺癌組織包括主要與次要2個分級區(qū)，各5分，Gleason評分為將2個區(qū)域分值相加。1級：形狀大小一致的大腺體密集排列形成小結節(jié)，不侵犯前列腺周圍組織；2級：排列較為疏松的圓形/卵圓形腺體形成小結節(jié)；3級：浸潤性生長的腺體，大小、形態(tài)各異；4級：腺體融合，邊緣有浸潤巢或浸潤帶，邊界不清晰。5級：實性癌巢，腺腔幾乎完全消失。根據(jù)Gleason評分，2～4分為高分化，5～7分為中分化，8～10分為低分化。

1.4.3血清PSA結果判定 血清PSA檢測結果：0～4 μg/L 表示正常；4～10 μg/L表示可能發(fā)生前列腺癌；≥10 μg/L表示前列腺癌可能性非常大。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗，相關性采用Pearson等級法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1Shh、Ptch-1、Gli-1在前列腺癌組織與癌旁正常組織表達情況比較 細胞核、細胞質內出現(xiàn)棕黃色/棕褐色顆粒即為陽性。Shh、蛋白陽性信號主要表達于細胞質或細胞膜；Ptch-1蛋白陽性信號主要表達于細胞質中；Gli-1蛋白陽性信號主要表達于細胞核或細胞質中(圖1，2)。前列腺癌組織標本Shh、Ptch-l、Gli-l陽性表達率均顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 Shh、Ptch-1、Gli-1在前列腺癌組織與癌旁組織表達情況(HE ×100)A.前列腺癌組織Shh陰性表達；B.前列腺癌組織Shh陽性表達；C.前列腺癌組織Ptch-1弱陽性表達；D.前列腺癌組織Ptch-1陽性表達；E.前列腺癌組織Gli-1陽性表達Figure 1 Expression of Shh, Ptch-1 and Gli-1 in prostate cancer tissues and adjacent tissues (HE ×100)圖2 Shh、Ptch-1、Gli-1在前列腺癌組織與癌旁正常組織表達情況(RT-PCR)Figure 2 Expression of Shh, Ptch-1 and Gli-1 in prostate cancer tissues and adjacent normal tissues (RT-PCR)

表2 Shh、Ptch-1、Gli-1在前列腺癌組織與癌旁正常組織表達情況比較Table 2 Comparison of the expressions of Shh, Ptch-1 andGli-1 in prostate cancer tissues and adjacent normal tissues (n=60，例數(shù)，%)

2.2前列腺癌組織Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達相關性分析 前列腺癌組織標本中Shh與Ptch-1呈正相關(r=0.698,P<0.001)，Shh與Gli-1,Ptch-1 與Gli-1無相關性(r=0.087、0.113，P=0.628、0.527) 。

2.3前列腺癌組織Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達與臨床分期、分化程度、血清PSA含量的相關性分析 不同臨床分期、分化程度、血清PSA含量前列腺癌組織Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。 前列腺癌組織Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達情況與臨床分期、分化程度、血清PSA含量均呈正相關(r=0.751,0.677,0.702,0.733,0.809,0.901,0.749,0.694,0.843;P=0.005,0.002,0.021,0.009,0.001,0.031,0.014,0.004,0.008)，表現(xiàn)為臨床分期越晚、分化程度越低、血清PSA含量越高Shh、Ptch-1、Gli-1表達水平越高。

表3 不同臨床分期、分化程度、血清PSA含量前列腺癌組織Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達量比較Table 3 Comparison of mRNA expression levels of Shh, Ptch-1 and Gli-1 in prostate cancer tissues with different clinical stages, degrees of differentiation and serum PSA level

3 討 論

隨著PSA早期篩查技術的普及，前列腺癌的發(fā)病率在近年來逐年上升。Issacs等[7]推薦使用熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP-90)對抗劑17-AAG治療晚期前列腺癌，但治療效果并不理想。許多研究證實了腫瘤的發(fā)生與Hh信號通路的異常激活有密切關聯(lián)，了解Hh信號通路與前列腺癌發(fā)生、進展間的關聯(lián)對找尋前列腺癌特異性診斷標記物與特效藥的研究具有重要意義。

Hh是對胚胎發(fā)育具有調控作用的高度保守的信號通路，主要由分泌蛋白Hh、跨膜蛋白Ptch與Smo、轉錄因子Gli、鋅指轉錄因子Ci等構成。脊椎動物中，Shh、印度刺猬因子(indian Hedgehog，Ihh)、沙漠刺猬因子(desert Hedgehog，Dhh)均為Hh基因的同源基因，編碼對應的蛋白，這些蛋白均為分泌蛋白，可以進行自我催化[8]。其中Shh作用最為廣泛，其參與神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、腦、四肢等發(fā)育過程[9]。人類Ptch受體家族包括Ptch-1、Ptch-2兩個同源基因，分別編碼對應蛋白。該受體家族蛋白含有兩個結合Hh蛋白不可或缺的胞外結構域袢。Ptch即是Hh的轉錄性目標，同時也是它的受體，Ptch的表達提示Hh信號通路被激活[10]。其具體過程為Hh作用于Ptch受體家族，若沒有Hh蛋白，則Ptch-1、Ptch-2會抑制Smo活性并阻礙信號傳遞[11]。Hh出現(xiàn)后該通路會被重新激活并引起下游信號傳遞，最終誘導Gli活化。脊椎動物中包含Gli 3個等位基因，分別是Gli-1、Gli-2、Gli-3，其中Gli-1是最關鍵的信號分子，其表達水平上調會誘發(fā)目的基因轉錄，推動腫瘤的發(fā)生與進展。在膠質瘤、髓母細胞瘤、人基底細胞癌中均可發(fā)現(xiàn)Gli-1異常表達[12]，Gli-1 RNA可以抑制腫瘤細胞增殖并誘導其發(fā)生凋亡。Gli-1是激活Hh信號通路的重要因子，其可以調節(jié)轉錄過程，Gli-1 mRNA是Hh信號通路活化的早期標志。Sanchez等[13]對前列腺癌、前列腺癌前癌變、前列腺良性病變標本進行檢測后發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織標本中Shh、Ptch-1、Gli-1均呈高表達。本研究對60例前列腺癌組織與前列腺癌旁組織標本進行檢驗發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中Shh、Ptch-l、Gli-l陽性表達率顯著高于前列腺癌旁組織(P<0.05)，提示在前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展過程中，Hh信號通路均起到了重要的調控作用。

Sanchez等[13]通過原位雜交觀察Shh、Ptch-1在前列腺癌、前列腺癌前癌變、前列腺良性病變標本組織中的表達情況，指出前列腺癌組織中Shh、Ptch-1均呈高表達，但與Gleason評分等其他因素無明顯關聯(lián)。本研究結果顯示，在前列腺癌組織與癌旁組織中均檢出了Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達，提示在前列腺癌組織與前列腺癌旁正常組織中Hh信號通路存在不同程度的活化，Gli-1在前列腺癌組織中表達水平更高(P<0.05)，在前列腺癌組織Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達與前列腺癌分化程度對比中Gli-1在低、中、高分化前列腺癌組織標本中均呈100%陽性表達，說明Gli-1在反映前列腺癌分化程度方面具有比Shh、Ptch-1更高的準確性，提示Gli-1可能成為前列腺癌治療的理想分子靶點。

PSA是公認的前列腺瘤指標，也是前列腺癌術后的一項隨訪指標。血清PSA含量檢測時前列腺癌篩查的常用手段，但其對前列腺癌并無特異性，而是表現(xiàn)為器官特異性[14]。血清PSA水平異常上調并不能確認為前列腺癌，前列腺增生、急性前列腺炎、前列腺穿刺、膀胱鏡檢查等均會對PSA的血清含量產生波動[15-16]，故PSA僅可提示存在前列腺疾病，對前列腺癌的診斷需要依靠其他特異性指標。國內外有許多PSA與前列腺癌臨床分期、分化程度的研究報道，但尚未得出統(tǒng)一結論[17]。本研究探討了Shh、Ptch-1、Gli-1與前列腺癌臨床分期、分化程度及血清PSA含量的關系，結果表明前列腺癌組織Shh、Ptch-1、Gli-1 mRNA表達情況與臨床分期、分化程度、血清PSA含量表呈正相關(P<0.05)，具體表現(xiàn)為臨床分期越晚、分化程度越低、血清PSA含量越高Shh、Ptch-1、Gli-1表達水平越高。Kim等[18]在報道中指出PSA水平上調只能在一定程度上說明Hh信號通路被異常激活，考慮到Hh信號通路異常激活可能還受到其他因素的調控，故血清PSA水平與Hh信號通路的相關性還有待研究。推薦前列腺癌的臨床診斷參考血清PSA、Shh、Ptch-1、Gli-1等多項指標進行綜合評估。

本研究結果顯示，前列腺癌組織標本中Shh與Ptch-1的表達呈正相關(P<0.05)，Shh與Gli-1、Ptch-1 與Gli-1 mRNA表達也無相關性(P>0.05)。但有研究發(fā)現(xiàn)藜蘆屬百合科植物中提取的環(huán)巴明可以抑制Hh信號通路[19]，但Gli過表達可以繞過這一通路，表現(xiàn)出不被抑制增殖。Karhadkar等[20]研究發(fā)現(xiàn)，12例腫瘤均發(fā)現(xiàn)Shh轉錄，但Ptch-1與Gli-1僅3例表達。本研究中也出現(xiàn)Shh不表達但Ptch-1與Gli-1 表達的情況，證實了在Hh信號通路中還有其他因素影響該信號通路活性。

綜上所述，前列腺癌組織中Shh、Ptch-1、Gli-1均呈高表達，且與前列腺癌臨床分期、分化程度等均有一定關聯(lián)，故該通路可能作為前列腺癌的理想分子靶點，在前列腺癌的診治工作中具有重要價值。